Name: a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה נערכו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול והטיפול האתיים בבעלי חיים, ועל-פי פרוטוקול שימוש בבעלי החיים אושר IACUC. תחזוקת קו 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי BAF3 תרבות במדיו?...

<ol>
	<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li><li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment.">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li><li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors:+insights+into+drug+design+from+structure.">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li><li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification.">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li><li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+(STI571)+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia.">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li><li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR/ABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+(STI571)+resistance.">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li><li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571/imatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL.">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR/ABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance.">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance.">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li><li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine.">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li><li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia.">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li><li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms.">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li><li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy.">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li><li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor.">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437 (2012).</li><li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition.">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503.">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138 (2013).</li></ol>

ההצלחה הקלינית של גליבק בטיפול CML הפגינה לא רק את הפוטנציאל של מיקוד קינאז האודם על ידי מעכבי מולקולה קטנים, אבל מגבלות גם חשפו טיפול ממוקד: חזרה קליני והופעה של מוטציות עמידות לתרופות בגן המטרה. זיהוי מוטציות התנגדות מסייע בניהול ופיתוח טובים יותר של מעכבי הדור הבא ק...

קינאז החלבון הם אנזימים רגולטוריים מרכזיים של מסלולי העברת אותות תוך-תאיים שלכאורה לווסת כל פונקציה סלולרית. בקרה נאותה של איתות kinase בתיווך היא קריטית להומאוסטזיס ופיתוח, אשר רובם מסתמך על רגולציה ראויה של קינאזות, phosphatases והשפלה שלה על ידי UPS (מערכת היוביקוויטין פרוטאזום). קינאז deregulated נמצא במרכז הבמה של סוגי סרטן רבים ומעורב בשורה של מחלות בבני אדם 1. הגנום אנושי מקודד יותר מ -500 קינאז חלבון שנקשר, במישרין או בעקיפין, ל~ 400 מחלות אנושיות 2. תצפיות אלה תמכו ברעיון למיקוד טיפולי של קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנים 3-5. ההפגנה של מעכבי קינאז ABL, כגון גליבק, בטיפול בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) סיפקה את ההוכחה של מושג לגישה זו 6,7. תצפית זו מהפכה בנמלים לא רקi-kinase טיפול אלא גם נאכף הרעיון לזהות נגעים הגנטיים במחלות אחרות גידולים למיקוד טיפולי, שתובלנה לגילוי של מוטציות סרטניות בJAK2 מפוליציטמיה (PV) וחולים עם שאתות myeloproliferative (MPN). תגלית זו עוררה עניין רב בטיפול בMPNs על ידי מיקוד JAK2 במעכבי קינאז מולקולה קטן. עכשיו, כמעט תריסר של מעכבי JAK2 נמצאים בניסויים קליניים ואחד מהם אושר לאחרונה לטיפול במיילופיברוזיס ראשוני. בעוד מיקוד ספציפי של קינאזות שעור על ידי מעכבי מולקולה קטנים בסרטן להביא תוצאות מבטיחות, היא גם סובלת ממפתחים עמידים לטיפול. למעשה, עד כה, חולים שטופלו במעכבים קינאז, כגון גליבק, ארסתי, Erlotinib וdasatinib פיתחו מוטציות התנגדות בעיקר על ידי רכישת מוטציות בתחום קינאז שתרופה מיועדת ל8-10. התנגדות כתוצאה ממוטציה בגן מדגישה את המגבלות of ממוקדת טיפול יחיד נגד קינאז שהעור, ומייצגת את האתגר הבא בהתפתחות של סרטן כימותרפיה יותר ויותר מוצלחת. השלכות מכניסטית ופונקציונליות של עמידות לתרופות צריכות לספק רציונל לבחירה ועיצוב של תרכובות משלימות לפיתוח תרופות. מוטציות שזוהו באמצעות מסכי במבחנה, הראו רמה גבוהה של מתאם עם אלה שנמצאו בחולים. לכן, הקרנה במבחנה למוטציות המעניקות סמים התנגדות לזוגות יעד תרופה ניתנו באסיסטים פיתוח קליניים או פרה-קליניים בזיהוי דפוסי ההתנגדות שעלול לגרום להישנות קלינית. זיהוי של מוטציות אלה הוא לא רק מועיל בניטור החולים לתגובת סמים ולהרע, אלא גם חיונית לעיצוב של מעכבי הדור הבא חזקים יותר. לדוגמא, פיתוח של מעכבי BCR / ABL הדור הבא, Nilotinib וPonatinib, התאפשרו בגלל MEC יותרהבנות hanistic צברו מmutagenesis, מבני, ומחקרים תפקודיים. מוקדם יותר, יש לנו דיווחו על התוצאות של המסך שלנו באמצעות mutagenesis של BCR / ABL האקראי כדי לחשוף את הספקטרום של מוטציות המקנות עמידות למעכבים כגון 11,12 גליבק, 12 PD166326, ו -13 AP24163. התוצאות לא רק זיהו את המוטציות המקנות הישנות התנגדות ומחלה קלינית, אלא גם סיפקו את הבנת מכניסטית של עמידות לתרופות ולעקרונות המסדירים את תפקוד kinase 11,14. כאן אנו מספקים פירוט מתודולוגיים נוסף, באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כדי לאפשר יישום רחב יותר של אסטרטגית הקרנה זו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">name of Materials/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:453px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell and Tissue culture&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaF3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td>
			<td>A gift from Ross Levine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-V617F-Cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-Luciferase-puro.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trapan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INCB018424 (Ruxolitinib)</td>
			<td>ChemieTeK</td>
			<td>941678-49-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL-1 red E.Coli cells</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>100mg/ml stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood&#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Expand long template PCR system</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1168134001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Sv gel and PCR clean up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Yield plasmid mini prep system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &#38; OmniMAX 2 Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12535029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#160; LR Clonase Enzyme mix&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td colspan="2">60316 and 60317</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

הגילוי של BCR / ABL כאונקוגן נהג בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) הביא לפיתוח של גליבק, אשר, למעשה, הוכיח את הפוטנציאל של מיקוד kinase בסרטן על ידי יעילות טיפול בחולי CML. תצפית זו חוללה מהפכה בפיתוח תרופות למקד קינאז שהעור מעורב בגידולים ממאירים שונים אחרים, כגון, EGFR, B-RAF, KIT וPDGFRs. עם זאת, חסרון עיקרי אחד של טיפולים אנטי-kinase הוא ההופעה של מוטציות עמידות לתרופות טיוח היעד להפחיתה או איבדה את הזיקה לסמים. הבנת המנגנונים המועסקים על ידי גרסאות עמידות לא רק עוזרת בפיתוח מעכבי הדור הבאים, אלא גם נותנת תנופה לניהול קליני באמצעות רפואה אישית. דיווחנו אסטרטגית retroviral וקטור מבוססת הקרנה לזהות את הספקטרום של ההתנגדות המקנה מוטציות בBCR / ABL, אשר סייעה בפיתוח הדור הבא BCR / ABL מעכבים. באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כאן אנו מתארים בשיטות הקרנה חוץ גופית שמנצלות את תאי BAF3 העכבר מבטאים את ספריית המוטציה האקראית של קינאז JAK2.

הופעתה של מוטציות גנטיות מהווה אתגר גדול עבור הטיפול אנטי kinase הממוקד. מחקרי מוטאציות, מלבד מתן תובנות מכניסטית ופונקציונליות שהם סייעו בבחירה ועיצוב של פיתוח תרופות מהדור הבא, גם מאפשר ניהול קליני טוב יותר ועשויים בעתיד להיות מועיל יותר לטיפול מותאם אישית. בניסוי זה...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוטציות עמידות במבחנה.

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

השיטה MODS לאבחון שחפת שחפת עמידים multidrug

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...