Name: a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом протоколе были проведены в соответствии с Национальным институтом руководящих принципов здравоохранения для этического обращения и ухода за животными, и в соответствии с утвержденным IACUC использования животных протокола. 1. Клеточная ли...

<ol>
	<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li><li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment.">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li><li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors:+insights+into+drug+design+from+structure.">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li><li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification.">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li><li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+(STI571)+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia.">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li><li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR/ABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+(STI571)+resistance.">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li><li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571/imatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL.">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR/ABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance.">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance.">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li><li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine.">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li><li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia.">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li><li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms.">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li><li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy.">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li><li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor.">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437 (2012).</li><li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition.">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503.">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138 (2013).</li></ol>

Клинический успех иматиниба в лечении ХМЛ продемонстрировали не только потенциал таргетинга румяна киназы по низкомолекулярные ингибиторы, но и раскрыли ограничения таргетной терапии: клиническое рецидива и появления мутаций лекарственной устойчивости в гене-мишени. Идентификация...

Протеинкиназы ключевых регуляторных ферментов внутриклеточных путей передачи сигналов, которые, казалось бы, модулируют каждый клеточной функции. Надлежащий контроль за киназный сигнализации имеет решающее значение для гомеостаза и развития, которые в основном опирается на надлежащее регулирование киназ, фосфатаз и его деградации по UPS (системы протеасома убикитина). Дерегулированных киназы находятся в центре внимания многих видов рака и участвуют в принимающих заболеваний человека 1. Геном человека кодирует более чем 500 протеинкиназы, которые были связаны, прямо или косвенно, ~ 400 заболеваний человека 2. Эти наблюдения поддерживают концепцию терапевтического нацеливания киназ по низкомолекулярные ингибиторы 3-5. Демонстрация ABL ингибиторов киназы, такие как иматиниба, в лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) при условии, что доказательство концепции для этого подхода 6,7. Это наблюдение не только революцию в муравьяя-киназы терапия, но и в жизнь идею, чтобы определить генетические повреждения в других опухолевых заболеваний для терапевтического нацеливания, которые приводят к открытию онкогенных мутаций в JAK2 от истинной полицитемии (PV) и у пациентов с миелопролиферативных опухолей (MPN). Это открытие вызвало большой интерес в лечении MPNs путем охвата JAK2 с низкомолекулярных ингибиторов киназ. Теперь, почти десяток ингибиторов JAK2 в клинических испытаниях, и один из них был утвержден в последнее время для лечения миелофиброзом. В то время как специфическое нацеливание онкогенных киназ путем низкомолекулярные ингибиторы в раковых привести перспективный результат, он также страдает от развития резистентности к лечению. В самом деле, до сих пор, у пациентов, получавших ингибиторы киназы, такие как иматиниба, Gefitinib, Erlotinib и Dasatinib разработанные мутаций устойчивости в основном за счет приобретения мутаций в домене киназы, в которой лекарственных препаратов 8-10. Сопротивление в результате мутации гена подчеркивает ограничения уплотнительныеF направлена ​​против монотерапии онкогенных киназ, и представляет собой следующий вызов в развитии все более успешной химиотерапии рака. Механистические и функциональные последствия лекарственной устойчивости должны обеспечить обоснование для выбора и проектирования бесплатные соединений для разработки лекарственных препаратов. Мутации, идентифицированные с помощью экранов в пробирке, показали высокую степень корреляции с тем, у больных. Таким образом, скрининг в пробирке для мутаций, которые придают лекарственную устойчивость для данного препарата целевых пар в клинических или доклинических способствует развитию в определении моделей устойчивости, которые могут привести к клинической рецидив. Идентификация этих мутантных форм не только полезно для мониторинга пациентов для ответа наркотиков и рецидивов, но также имеет важное значение для разработки более надежных ингибиторов следующего поколения. Например, развитие следующего поколения ингибиторов BCR / ABL, Nilotinib и Ponatinib, стало возможным из-за большей тесhanistic понимание получил от мутагенеза, структурных и функциональных исследований. Ранее мы уже сообщали результаты нашего экрана с помощью случайного мутагенеза в BCR / ABL, чтобы выявить спектр мутаций, придающих устойчивость к ингибиторам, таких как иматиниба 11,12, PD166326 12, и AP24163 13. Результаты не только определили мутации, придающие клинической резистентности и болезни рецидив, но и при условии, что механическое понимание лекарственной устойчивости и принципов, регулирующих функцию киназы 11,14. Здесь мы предлагаем дополнительную методическую деталь, с помощью Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевого пары наркотиков, с тем чтобы более широкое применение этой стратегии скрининга.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">name of Materials/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:453px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell and Tissue culture&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaF3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td>
			<td>A gift from Ross Levine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-V617F-Cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-Luciferase-puro.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trapan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INCB018424 (Ruxolitinib)</td>
			<td>ChemieTeK</td>
			<td>941678-49-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL-1 red E.Coli cells</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>100mg/ml stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood&#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Expand long template PCR system</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1168134001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Sv gel and PCR clean up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Yield plasmid mini prep system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &#38; OmniMAX 2 Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12535029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#160; LR Clonase Enzyme mix&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td colspan="2">60316 and 60317</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

Открытие BCR / ABL как онкоген драйвера в хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) привело к разработке иматиниба, который, по сути, продемонстрировали потенциал ориентации киназы в раковых путем эффективного лечения больных ХМЛ. Это наблюдение революцию разработки лекарственных средств целевой онкогенных киназ, вовлеченных в различных других злокачественных опухолей, таких как, EGFR, B-RAF, KIT и PDGFRs. Тем не менее, один главный недостаток анти-киназы терапии является появление лекарственной устойчивости мутаций, оказывающих цель уменьшили или потеряли сродство к препарату. Понимание механизмов, занятых устойчивыми вариантов не только помогает в разработке ингибиторов нового поколения, но и дает толчок к клиническому ведению помощью персонализированной медицины. Мы сообщили ретровирусной стратегия скрининга для выявления спектра сопротивления, придающего мутации в BCR / ABL, который помог в разработке следующего поколения BCR / ABL ингибиторов. Использование Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевой препарат пары, здесь мы опишем в пробирке методов скрининга, который использует мышь BAF3 клетки, экспрессирующие случайные мутации библиотеку JAK2 киназы.

Появление генетических мутаций представляет большую проблему для целевой анти-киназы терапии. Мутационные исследования, помимо предоставления механистической и функциональные идеи, которые играют важную роль в выборе и проектировании разработки следующего поколения наркотиков, а ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Появление генетической устойчивостью против ингибитора киназы терапии представляет серьезную проблему для эффективной терапии рака. Определение и характеристика мутаций устойчивости против недавно разработанного препарата способствует лучшему клинического лечения и следующего поколения дизайна лекарств. Здесь мы описываем наш протокол для скрининга и подтверждения устойчивых мутаций в пробирке.

Метод скрининга и проверка мутаций устойчивости против ингибиторов киназ

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Введение. stephensi Эмбрионы для генерации устойчивых к малярии комаров

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Применение допамина Элеганс C. Анализ дегенерация нейронов для проверки потенциальных болезни Паркинсона Гены

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

MODS метод диагностики туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Опробование киназы Деятельность LRRK2 В пробирке</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

РНК Catalyst в качестве корреспондента Скрининг препаратов против РНК редактирования в трипаносом

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Идентификация киназы-подложки пар Использование высокопроизводительного скрининга


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Протокол для строительства Domainome Библиотека, проверки и отбора Фаговые отображения и следующего поколения последовательности

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...