Name: single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00
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Dieses Projekt wurde vom Land Baden-Württemberg sowie von der Europäischen Union, Europäischer Fonds finanziert für sterben Regionale entwicklung. Die Autoren danken Rainer Wittig (ILM Ulm) für die Bereitstellung der U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Zelllinie und Claudia Hintze für geschickte technische Hilfe.

1. Zell Sphäroid wächst und Inkubation <ol><li> Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert <ol><li> Bereiten Agarose 1,5% im Kulturmedium durch Zugabe von 0,45 g Agarose auf 30 ml Kulturmedium (ausreichend für 6 Platten). </li><li> Das Gemisch aus Schritt 1.1.1 auf mindestens 80 ° C unter Rühren von Zeit zu Zeit. </li><li> Füllen Sie 50 ul der erhitzten Mischung aus Schritt 1.1.2 in jedes Well einer 96-Well-Platte und lassen Sie es in 1-2 Stunden fest werden. Lagern Sie die Platten geschl...

<ol>
	<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).</li><li>Webb, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+optical+microscopy.">Confocal optical microscopy.</a> Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).</li><li>Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+obtaining+optical+sectioning+by+using+structured+light+in+a+conventional+microscope.">Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope.</a> Opt. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+development+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in development biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high+throughput+screening:+the+multi-cellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+fluorescence+microscopy+of+living+cells.">Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells.</a> J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy.">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue.">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).</li><li>Mertz, J., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+light-sheet+microscopy+in+the+whole+mouse+brain+with+HiLo+background+rejection.">Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).</li><li>Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams.">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li><li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy.">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).</li><li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration.">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li><li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li><li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation.">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li><li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) Gerät, das für 3-dimensionale Zellsysteme optimiert ist, zB, mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). Drei beispielhafte Anwendungen umfassen (1) die Aufnahme eines Zytostatikums und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt (deren Beitrag zur chemotherapeutischen Wirksamkeit bleibt ausgewertet werden), (2) Messung des Redox-Zustand durch Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor auf Zugabe e...

Neben den gut etablierten Methoden (oder konfokalen Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie 1-4, Structured Illumination Microscopy 5,6) Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) hat sich als eine wertvolle Methode der 3D-Bildgebung 7,8 sein, 9. Von besonderem Interesse ist die Anwendung eines 3-dimensionalen Zellkulturen, beispielsweise multizellulären Tumor-Sphäroide (MCT), die zunehmend für die Wirkstoffforschung 10,11 verwendet werden. Darüber hinaus ist eine bevorzugte Methode SPIM, wenn auch bei langfristiger Exposition oder sich wiederholende Messungen schlechten Licht Dosen sind erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Probe zu erhalten, da für die Messung von jeder Ebene der Probe nur diese Ebene dem Licht ausgesetzt wird. Dies steht im Gegensatz zu anderen Mikroskopietechniken, wobei zur Detektion der jeweiligen Brennebene die gesamte Probe beleuchtet wird, so daß bei der Aufzeichnung einer Vielzahl von Ebenen, die die Lichtdosis summiert und kann die Probe 12 zu beschädigen. </p&gt; Lichtschnittmikroskopie oder SPIM auf Beleuchtung der Probe in Richtung senkrecht zur Beobachtungspfad entweder durch die Verwendung einer Zylinderlinse oder durch Abtasten des anregenden Laserstrahls (für eine Übersicht siehe Ref. 8) basiert. Dies erfordert oft spezielle Probenkammern 13,14 oder Matrizen, zB Agarose 7,15, in speziellen High-Cost-Mikroskopen implementiert. Als Alternative zu diesen Systemen eine vergleichsweise einfache Beleuchtungseinrichtung für SPIM wurde entwickelt und mit einem herkömmlichen inversen Mikroskop 16 (siehe Figur 1) angepaßt ist. Es besteht aus einem Laserstrahl auf einen Durchmesser von 8 mm durch eine Zylinderlinse (Fokuslänge: 50 mm, numerische Apertur: 0,08) erweitert und fokussiert, um einen Lichtschnitt von 6-10 um Dicke über eine Schärfentiefe von etwa 100 um . Proben werden in einer rechteckigen Kapillare mit 600-900 um Innendurchmesser vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet len ​​befindets für die Fluoreszenzdetektion. Diese Hauptmerkmale werden gegenwärtig abgeschlossen und durch die Verwendung von fortschrittlichen Mikrokapillare Ansätze zum Halten und zum Drehen der Proben, die synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtblatt (in axialer Richtung) und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion (identischen optischen Pfad eingesetzt optimiert Längen Verschiebung erfordern eine Korrektur der mechanischen Vorschub) und die Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von fluoreszierenden Farbstoffen, pharmazeutischen Wirkstoffen oder Arzneimitteln, damit die erforderliche Menge und Kosten zu minimieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:243px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">&#160;Catalog Number</td>
			<td style="width:376px;">Comments/Description(optional)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microtiter plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430100</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">agarose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3810.1</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">MCF-7 cell line</td>
			<td>CLS Cell Lines Service GmbH</td>
			<td>300273</td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">U251-MG-L106 cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG0435</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG4815</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">FCS</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>S0615</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">hygromycin B</td>
			<td style="width:201px;">PAA Laboratories&#160;&#160;</td>
			<td>P02-015</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">EBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>E3024</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D1515</td>
			<td>fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">green cytotoxicity dye</td>
			<td>Promega GmbH</td>
			<td>G8742</td>
			<td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>R8875</td>
			<td>cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>95302</td>
			<td>reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">capillary</td>
			<td>VitroCom&#160;</td>
			<td>8260-050</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Jena</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioCam MRc CCD-camera</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>426508-9901-000</td>
			<td>CCD-camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioVision data aquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">laser diode</td>
			<td>Pico Quant GmbH</td>
			<td>LDH-P-C-470</td>
			<td>used with driver PDL800-B</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">perestaltic pump</td>
			<td>Ismatec Labortechnik</td>
			<td>MS-1 Reglo</td>
			<td>re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">silicone tubes</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science GmbH</td>
			<td>TYGON R3607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Ein Modul für Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einem umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert, zB mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). SPIM Anregungsmodul Formen und lenkt das Licht, so dass die Probe durch einen Lichtschnitt senkrecht zur Detektion Gang des Mikroskops beleuchtet. Das System wird durch Verwendung einer rechteckigen Kapillare zur Aufnahme (und in einer erweiterten Version auch durch eine Mikrokapillare Ansatz zum Drehen) der Proben, durch synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtbogen und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion verwendet wird, sowie dadurch gekennzeichnet, durch Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen. Ein Protokoll für die Arbeit mit diesem System gegeben wird, und einige technische Details berichtet. Repräsentative Ergebnisse umfassen (1) Messungen der bisnehmen eines Zytostatikums (Doxorubicin) und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt, (2) Redox-Messungen unter Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor bei Zugabe eines Oxidationsmittels, und (3) die Einleitung und Kennzeichnung Zellnekrose auf Hemmung der mitochondrialen Atmungskette. Unterschiede und Vorteile der vorliegenden SPIM Modul im Vergleich mit bestehenden Systemen diskutiert.

Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert Ein Z-Stapel-Scan eines zuvor inkubiert MCF-7-Zell-Sphäroiden (8 uM Doxorubicin, 6 h) wird in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt ausführliche Informationen über die zelluläre Aufnahme und Verteilung von Doxorubicin 17 und seinem Abbauprodukt 18,19. In der äußeren Zellschicht der Sphäroid roten Fluoreszenz Doxorubicin wird hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, wäh...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden.

Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

Research

JoVE Journal

Engineering

Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

Bau einer Hohe Auflösung Mikroskop mit Konventionelle und Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

Forschung

Ingenieurwesen

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Die Analyse der Kontaktschnittstellen für Einzel GaN-Nanodraht-Geräte

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