Name: from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope at JoVE.com

This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

כיול מערכת .1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פונקצית מורחים נקודת כיול (כוחות הביטחון הפלסטיניים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 10 μl של 30 פתרון חרוז ניאון ננומטר (כ -5 מיקרומטר) ב90 μl של מים מזוקקים ולאחר מכן sonicate הפתרון עבור 20 דק...

מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) מייצג את אחת מהאסטרטגיות הנפוצות ביותר ללמוד דינמיקה מולקולרית ויש לו את היתרון הגדול של מדידת מסלולי חלקיקים. זה בתורו מאפשר חיטוט ההתנהגות של כמה אפילו חלקיקים שכותרתו במערכת מורכבת. עם זאת, כדי להגיע ליתרון זה SPT בדרך כלל זקוק לצפיפות נמ...

החל מהמודל המקורי &quot;פסיפס נוזל&quot; על ידי זינגר וניקולסון, התמונה של קרום פלזמה סלולארי כבר מעודכנת באופן רציף במהלך העשורים האחרונים על מנת לכלול את התפקיד המתפתח של תחומים שלד תא ושומנים בדם 1,2. התצפיות הראשונות התקבלו על ידי שחזור ניאון לאחר photobleaching הסרת לוט (FRAP) שחלק ניכר של חלבונים בממברנה הוא נייח 3-5. מחקריו החלוציים הללו, למרות שמאוד אינפורמטיבי, סבלו מעניה יחסית ברזולוציה במרחב (מיקרון) וזמן (שניות) של מערכי FRAP. כמו כן, להיות מדידת מיצוע הרכב, FRAP חסר במתן מידע על מולקולה בודדת התנהגות. בהקשר זה, את האפשרות לתייג מולקולה בודדת עם תגים בהירים מאוד (המאפשרים מחקר של המולקולה אחת תהליך דיפוזיה בכל פעם) במיוחד היה מוצלח מאוד. במיוחד, על ידי לחיצה עלרזולוציה של הגישה יחידה חלקיקים מעקב (SPT) ללוח הזמנים מיקרו, Kusumi, et גישה צברה אל. לתכונות ידועות של דינמיקת שומנים וחלבונים שתרמו רב להכרה בתפקידו של שלד קרום מבוסס אקטין בפיזיולוגיה קרום 6 זמן , 7. ממצאים אלה שנוצרו מה שנקרא &#39;כלונסאות וגדר&#39; מודל, שבו דיפוזיה שומנים והחלבונים מוסדרת על ידי שלד מבוסס אקטין. עם זאת, על מנת לקבל גישה לכמות העצומה של מידע המסופק על ידי נושאים רבים ניסיוניים SPT יש לטפל. במיוחד, הליך התיוג מורכב בדרך כלל על ידי צעדים רבים כמו ייצור, טיהור והכנסה של המינים שכותרתו לתוך המערכת. יתר על כן, חברות תקליטים גדולות, כמו נקודות קוונטיות או חלקיקי מתכת, נדרשות לעתים קרובות כדי להגיע ללוח זמנים משנה אלפית השנייה וcrosslinking של מולקולות המטרה על ידי התווית לא ניתן היה להימנע במקרים רבים. לבסוף, מסלולים רביםיש שיירשם כדי שיתאים לקריטריונים סטטיסטיים ובו זמנית בצפיפות נמוכה של התווית נדרש כדי לאפשר מעקב. בהשוואה לSPT, ספקטרוסקופיה מתאם הקרינה (FCS), להתגבר על רבים מחסרונות אלה, מייצגת גישה מאוד מבטיחה ללמוד דינמיקה מולקולרית. למעשה, FCS עובד היטב גם עם תוויות עמומות וצפופות, מה שמאפשר ללמוד את הדינמיקה של מולקולות מתויג חלבון פלואורסצנטי בתאי transfected הזמני. כמו כן, זה מאפשר להגיע לסטטיסטיקה גבוהה בכמות מוגבלת של זמן. לבסוף, למרות הצפיפות &quot;הגבוהה&quot; של תוויות FCS מספק מידע מולקולות בודדות. תודה לכל המאפיינים האלה, FCS מייצגת גישה מאוד פשוטה ויושם בהרחבה ללמוד דינמיקת שומנים וחלבונים הן בממברנות מודל ובשידור חיים תאים 8-10. גישות רבות ושונות הוצעו כדי להגביר את היכולת של FCS כדי לחשוף את הפרטים של דיפוזיה מולקולרית. לדוגמא, זה היה shשלו כי על ידי ביצוע FCS באזורי תצפית שונה בגודל אחד יכול להגדיר תכונות &quot;חוק דיפוזיה FCS&quot; מאיר עיניים מוסתרות של תנועה המולקולרית 11,12. חוץ מזה שהיה שונה בגודל, באזור המוקד היה גם משוכפל 13, עבר בחלל לאורך קווי 14-20 או מצומדות עם מצלמות מהירות 21,22. באמצעות המתאם &#39;מרחב ובזמן &quot;אלה גישות, פרמטרים ביולוגיים רלוונטיים של מספר מרכיבי קרום תוארו כמותית משני קרומי מודל ואלה ביולוגיים בפועל, ובכך תובנה מניבות לארגון המרחבי קרום. עם זאת, בכל FRAP ויישומי FCS שתואר עד כה בגודל של אזור המוקד מייצג מגבלה ברזולוציה מרחבית שלא ניתן להתגבר עליו. שיטות הדמיה ברזולוציה סופר כמה פותחו לאחרונה כדי לעקוף מגבלה זו. חלקם מבוססים על דיוק לוקליזציה, כגון מיקרוסקופיה אופטית סטוכסטיים שחזור (STORM) &lt;sup&gt; 23,24, מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation (PALM) 25, PALM הקרינה (FPALM) 26, וPALM מעקב חלקיק יחיד (sptPALM) 27: הכמות הגדולה יחסית של פוטונים הנדרשים בכל תמונה, לעומת זאת, מגביל את הרזולוציה של הזמן שיטות אלה לפחות כמה אלפיות השניה, ובכך פוגעות תחולתם in vivo. בניגוד לכך, חלופה מבטיחה להדמיה ברזולוציה סופר נפתח על ידי מרחבית ויסות פליטת הקרינה עם שיטות מגורה דלדול פליטה (STED או מעברים הפיכים saturable אופטי הקרינה (RESOLFT)) 28,29. גישות אלה משלבים עיצוב תצפית הנפח נמוך בהרבה מהמגבלה העקיפה עם האפשרות להשתמש מיקרוסקופי סריקה מהירה ומערכות איתור. בשילוב עם ניתוח תנודות הקרינה, מיקרוסקופיה STED אפשרה לחקור ישירות את דינמיקת spatiotemporal ננומטריים של שומנים וproteins בקרום תא חי 30,31. ניתן להשיג את אותו כמויות הפיזיות של מיקרוסקופיה מבוססת STED ידי ספקטרוסקופיה הותאם מרחב ובזמן מתאם תמונה (STICS 32,33) שיטה שמתאימה ללימוד הדינמיקה של חלבוני fluorescently- מתויג קרום ו / או שומנים בתאים חיים ועל ידי מיקרוסקופ מסחרי. פרוטוקול הניסוי המובא כאן מורכב על ידי כמה צעדים. הראשון דורש הדמיה מהירה של האזור של עניין על הממברנה. לאחר מכן, הערימה של תמונות וכתוצאה מכך משמשת לחישוב פונקציות מתאם מרחב וזמן הממוצע. על ידי התאמת הסדרה של פונקציות מתאם, ניתן להשיג &quot;חוק דיפוזיה &#39;המולקולרי ישירות מהדמיה בצורה של diffusivity לכאורה (אפליקציה D) - לעומת עלילת עקירת -average. עלילה זו באופן ביקורתי תלויה בסביבה נבחנה על ידי המולקולות ומאפשרת הכרה ישירות מצבי דיפוזיה בפועלשל השומנים בדם / החלבון של עניין. בפרטים נוספים, כפי שמוצג 34 בעבר, פונקצית קורלציה אוטומטית מרחב ובזמן של סדרת תמונה שנרכשה באופן ביקורתי תלויה בדינמיקה של המולקולות נעות בסדרת התמונה שנאסף (יש לציין כי באותו ההיגיון ניתן להחיל ברכישת אונליין שבו רק ממד אחד בחלל נחשב). בפרט, אנו מגדירים את פונקצית המתאם הגבוהה ככל: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> (1) בי <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" /> מייצג את עוצמת הקרינה שנמדדה בx העמדה, y ובזמן t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" /> ו <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> מייצג את המרחק בx וכיווני y בהתאמה, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> מייצג את פער הזמן, ו <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" /> מייצג את הממוצע. פונקציה זו יכולה לבוא לידי ביטוי כמו: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> (2) שבו &#39;N&#39; מייצגת את המספר הממוצע של מולקולות באזור התצפית, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" /> מייצגת את פעולת פיתול בחלל, ו <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" /> מייצג את autocorrelation של המותניים אינסטרומנטלי. זה אחרון יכול להתפרש כמדד של כמה הפוטונים של פולט אחד פרושים במרחב בשל ההתקנה האופטית / הקלטה (פונקצית התפשטות הנקודה שנקרא, כוחות הביטחון הפלסטיניים, גןעצרת מקורב היטב על ידי פונקצית גאוס). לבסוף, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" /> מייצג את ההסתברות למצוא חלקיק במרחק <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" /> ו <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> לאחר השהיה <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> . אם ניקח בחשבון את דינמיקת diffusive, שבו חלקיקים לנוע באופן אקראי לכל הכיוונים ונתיבים נטו אינם נוכחים, פונקציה זו גם מקורב היטב על ידי פונקצית גאוס בי השונות יכולות להיות מזוהות כממוצעת כיכר העקירה (MSD) של החלקיקים המרגשים . לפיכך, המותניים של פונקצית המתאם (המכונה גם כ <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ), יכול להיות מוגדר כסכום של MSDS החלקיקים ומותני אינסטרומנטלי וניתן למדוד על ידי גאוס בכושרטינג של פונקצית המתאם עבור כל עיכוב זמן. אני MSD נמדד ניתן להשתמש כדי לחשב diffusivity לכאורה של המולקולות נעות <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" /> ועקירה ממוצעת <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" /> כ: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> (4) שיקולים כמה בהגדרת הניסוי נעשה שימוש יכול להנחות את הקורא בכל הסעיפים הבאים. על מנת לרגש באופן סלקטיבי fluorophores על הקרום הבסיסי של תאי חיים נשתמש תאורה כוללת ההשתקפות פנימית (TIR), תוך שימוש בקרינת TIR מסחרי מיקרוסקופ (TIRF) (ניתן למצוא את פרטים בסעיף החומר). יתר על כן, על מנת לאסוף את ההקרינה דואר נשתמש מטרת הגדלה גבוהה (100x NA 1.47, צמצם מספרי גבוה נדרש לתאורת TIRF) ומצלמת EMCCD (גודל פיזי של פיקסל על מיקרומטר שבב 16). כדי להגיע לגודל פיקסל של 100 ננומטר אנחנו מיישמים עדשת הגדלה נוספת של 1.6x. כפי שנראה להלן, תידרש זמן ברזולוציה מתחת ל -1 msec כדי לתאר כראוי את הדינמיקה של שומני קרום מהירים להלן 100 ננומטר. על מנת להגיע לפתרון זמני זה אנחנו צריכים לבחור אזור של העניין (ROI) קטן יותר מכל השבב של המצלמה (512 x 512). בדרך זו, המצלמה תהיה לקרוא מספר מופחת של קווי הגדלת הרזולוציה הזמן. עם זאת, במשטר קריאה זו מסגרת הזמן יהיה מוגבל על ידי הזמן הנדרש כדי להעביר את החיובים מהחשיפה לשבב הקריאה על המצלמה והיא בדרך כלל בסדר הגודל של אלפיות שנייה לEMCCD 512 x 512 פיקסל. להכות מגבלה זו, טכנולוגיה מתפתחת מאפשרת הסטת ROI-הקווים רק במקום כל המסגרת, with הפחתה יעילה מעשית של הגודל נחשף שבב (הנקרא חיישן קצוץ מצב בEMCCD שלנו). לתצורה זו תהיה אפקטיבית, השבב מחוץ להחזר על ההשקעה חייב להיות מכוסה על ידי כמה חריצים רכובים בנתיב האופטי. הודות להתקנה זו רזולוציה זמן עד ל10 -4 שניות יכולים להיות מושגת. שים לב, עם זאת, כי גישה זו יכולה להיות בשילוב עם setups ניסיוני רב ושונה, כפי שהוסברה בסעיף &quot;הדיון&quot;. הפגנה של השיטה תסופק בתאים חיים, על ידי השימוש בשתי ATTO488 מסומן 1-palmitoyl-2-הידרוקסי sn -glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-PPE) וגרסה שכותרתו GFP של קולטן transferrin (GFP- TFR). במקרה של ATTO488-PPE גישה זו יכולה לשחזר בהצלחה יישום D כמעט קבוע כפונקציה של תזוזה ממוצעת המצביעה על דיפוזיה לרוב ללא תשלום, כפי שדווחה בעבר 30,35. בניגוד לכך, TFR-GFP תערוכות D יורד <suב יישום&gt; כפונקציה של תזוזה ממוצעת, המצביעה על דיפוזיה באופן חלקי-מוגבל 6. יתר על כן, במקרה האחרון זה אפשרי לכמת את הדיפוזיה המקומית ואזור הכליאה הממוצע מעל מיקרון רב במישור הקרום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי הפריסה המרחבית והתנועה של רכיבי קרום כמו שומנים וחלבונים הם גורמי מפתח בוויסות של פונקציות רבות תאיות. עם זאת, בשל הדינמיקה מהירה והמבנים הזעירים המעורבים, נדרשת רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה מאוד כדי לתפוס את ההתנהגות האמיתית של מולקולות. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הניסוי ללימוד הדינמיקה של חלבוני פלזמה קרום fluorescently שהכותרת ושומנים בתאים חיים עם רזולוציה spatiotemporal גבוהה. יש לציין, גישה זו אינה צריכה לעקוב אחר כל מולקולה, אך היא מחשבת התנהגות אוכלוסייה תוך שימוש בכל המולקולות באזור נתון של הקרום. נקודת המוצא היא הדמיה מהירה של אזור נתון על הממברנה. לאחר מכן, פונקצית autocorrelation מרחב ובזמן מוחלטת מחושבת מקשרת תמונות שנרכשו בהגדלת עיכובי זמן, למשל כל 2, 3, n חזרות. ניתן להוכיח כי הרוחבשל השיא של עליות פונקצית autocorrelation מרחבית בהגדלת עיכוב זמן כפונקציה של תנועת חלקיקים עקב דיפוזיה. לכן, ראוי של הסדרה של פונקציות autocorrelation מאפשר לחלץ את החלבון בפועל מתכוון עקירה מרובעת מההדמיה (iMSD), כאן מוצג בצורה של diffusivity לכאורה נגד עקירה ממוצעת. זה מניב מבט כמותית של הדינמיקה הממוצעת של מולקולות בודדות עם דיוק ננומטר. על ידי שימוש בגרסת GFP-tagged של transferrin קולטן (TFR) וATTO488 המסומנת 1-palmitoyl-2-הידרוקסי sn -glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) ניתן לצפות ברגולצית spatiotemporal של דיפוזיה חלבון והשומנים על אזורי קרום מיקרומטר בגודל בטווח זמן מיקרו ל-מילי שניות.

על מנת לכייל את המותניים אינסטרומנטלי, את דמותו של ננו חרוז ניאון בודד יכולה להיות מדד כמתואר בשלב פרוטוקול 1.1. תמונת ניאון אופיינית של חרוזים אלה מוצגת באיור 1. ההולם של חלוקת עוצמה על ידי פונקצית גאוס 2D נותן בחזרה שאריות טובות ומאפשר מדידת המותניים אינסטרומ...

Watch this Scientific Journal Video about From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope at JoVE.com

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...