Name: isolation of human mesenchymal stem cells and their cultivation on the porous bone matrix
Uploaded: 2015-02-09T13:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix at JoVE.com

אנו מכירים את המלגה ותמיכה כספית הניתנת על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 וDGAPA IN216213; סלבדור קוראה של Instituto Nacional de Perinatología לעזרה עם החומר הביולוגי; וBiocriss, SA de ג V על תרומת Nukbone. כמו כן תודה לאינג. הקטור מרטינז של IIM, UNAM וM en C פביולה גונזלס של CINVESTAV לקבלת סיוע טכני.

מחקר זה בוצע בהתאם להכרזה של ההסתדרות הרפואית העולמית של הלסינקי לגבי ההתנהגות האתית של בני אדם מחקר מעורב ואושר על ידי מועצת המנהלים מחקר האתיקה של Facultad de Medicina, UNAM (פרויקט מספר 101-2,012). 1. בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ותוספת 1% פתרון אנטיביוטיקה antimycotic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני של הנשר, גלוקוז גבוה (HG-DMEM) השתנה Dulbecco, ולהוסיף 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% solution.Sterilize אנטיביוטיקה antimycotic מדיום תרבות זו על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase השני ב 100 U / ml בHG-DMEM ללא FBS או פתרון אנטיביוטיקה antimycotic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכשירי הניתוח הבאים, אשר יש צורך לבידוד, על ידי מעוקר: מספריים סטנדרטייםים, מלקחיים לנתח פשוטים, עדין נקודה ומלקחי שיניים וידית אזמל (מס &#39;4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאי גזע mesenchymal של קרום מי שפיר אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את חבל הטבור ביד אחת ועם היד השנייה, לנתק את הקרום מי השפיר (בבוקר), שנראה כמו גיליון שקוף, כדי להשיג בר של כ 5 סנטימטר 2. אם הסעיף סיסית נמצא במדגם, להפריד סיסית בסיס על ידי נתיחה ידנית כסעיף סיסית הוא עבה יותר amnion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דם שייר עם שלושה שוטף של 5 מיליליטר של PBS ולהסיר קרישים עם המלקחיים הפשוטים. לעשות חתך קטן בבוקר עם האזמל כדי ליצור שברים של כ 0.5 סנטימטר 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול אנזימתי של קרום מי שפיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בבוקר, עם 5 מיליליטר של טריפסין 0.125% / 0.5 פתרון mM EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 37 ° C באווירת 5% CO 2. צנטריפוגה ב 250XG ו -25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את פתרון טריפסין על ידי השלכת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מיליליטר של collagenase סוג II פתרון דגירה במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2, כאשר מדי פעם רועדת לפי ייבה et al. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר עיכול עם collagenase השני, להוסיף 15 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG ו -25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף את הכדור הסלולרי עם 15 מיליליטר של תמיסת PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG ו -25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הסלולרי ב 10 מיליליטר של HG-DMEM ידי ניעור בעדינות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרחבות של תאי גזע mesenchymal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2 מיליליטר של השעיה תא (1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר) בבקבוק התרבות, ולהוסיף 2 מיליליטר של HG-DMEM ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. לחסל את התאים הלא-חסיד-ידי שינוי התרבות הבינוני לאחר 5-7ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פרק זמן זה, לשנות את התרבות בינונית כל 3 ימים ל7-10 ימים נוספים כדי להשיג מפגש סלולארי של 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את תאי דגירתם במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 עם 0.125% פתרון טריפסין / EDTA (trypsinization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר trypsinization, לאסוף תאים עם טפטפת והעברת צינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה הסלולרי ב 10 מיליליטר של HG-DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה תרבית תאים בשתי 75 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות (5 מיליליטר בבקבוק אחד), ולשמור על התרבות עד מפגש 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 1.4.3. ל1.4.6, עד המעבר או תת-תרבות -9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר תאים על ידי trypsinization כמו בשלבים 1.4.3 ל1.4.5 לזרימת cytometry או מחקרים אחרים. </li></ol></li></ol> 2. הכנת נקבובי עצם מטריקס הדיסק (NKB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את דיסקי NKB<html> (קוטר, 12 מ&quot;מ, עובי, 2 מ&quot;מ)., דגירה כל דיסק לילה עם 3 מיליליטר של HG-DMEM ללא FBS באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס, על פי et al Fassina 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תהליך ההרטבה, הנח את הדיסק בצינור חרוטי 50 מיליליטר וספין ב 250 XG במשך 5 דקות כדי להסיר בינוני תרבות עודפת. הנח את הדיסק בצלחת תרבית תאי 24 גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של HG-DMEM ו דגירה של 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. ודא שאין בועות נמצאות בדיסק NKB להעדיף חלוקה הנכונה של חומרים מזינים ותאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בועות הם נצפו בדיסק, לנער ולהוסיף 300 μl של מדיום התרבות ודגירה במשך 15 דקות באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרק זמן זה להסיר 300 μl של מדיום התרבות מוצצת דרך הקיר של תרבית תאים היטב ולוודא שאין בועות טופס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדיסק בצלחת 24 גם חדשה באמצעות מלקחיים פשוטים. </li></ol>= &quot;Jove_title&quot;&gt; 3. תרבות של תאי גזע mesenchymal האדם בשור מטריקס הנקבובי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי השעיה סלולרית (5 x 10 5 AM-hMSCs בשל HG-DMEM 100 μl) משלוש תת-תרבויות, על פני השטח של הדיסק הביולוגי-רטוב מראש דגירה במשך 30 דקות באווירת humidified של 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. לבצע שלב זה באיטיות ובאופן רציף על פני העליון של החומר הביולוגי כדי לאפשר לתאים אינטראקציה עם הטופוגרפיה של כל הפיגום. הערה: הליך זה משיג 60% מהתאים המצורפים בחומר הביולוגי שמוצג בטבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.5 מיליליטר של HG-DMEM על 37 מעלות צלזיוס, ולשמור על התרבות במשך 3 ימים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לא ליצור מערבולת בתוספת של מדיום תרבות ללהימנע מזה בתצהיר של תאים בתחתית צלחת צלחת התרבות. זו פעם ראשונה. </li></ol> אפיון סמני משטח 4. תא על ידי זרימת Cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים מתת-תרבות -9 לפני זריעתם על מטריצת הדיסק. השתמש 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ולתקן אותם למשך 30 דקות בפורמלדהיד 2% קרים כקרח. בעקבות קיבעון, לשטוף את התאים פעם אחת עם 0.05% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום הלא ספציפי מחייב על ידי דוגרים התאים עם 20% אימונוגלובולינים אנושיים במשך 3 דקות על קרח דגירה 0.1 x 10 6 aliquots תא עם Phycoerythrin (PerCP) -conjugated MAb נגד CD73, FITC מצומדות- MAb CD90, MAb PE-מצומדות נגד CD34 , FITC מצומדות- MAb CD45 וPE-מצומדות MAb CD105 עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס בחושך. התאמת אלוטיפ MAb מצומדות- FITC, MAb MAb andPerCP מצומדות- PE-מצומדות ישמש בקרות שליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את רמות הביטוי של סמני המשטח באמצעות תוכנה לאיסוף נתונים וניתוח. </li></ol> 5. תא הידבקות זיהוי על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את דגימות תאים-הדיסק ב 3 ימים של תרבות פעמיים עם PBSוfixthe דגימות עם glutaraldehyde 4% (V / V) solutionin 0.1 חיץ Na-cacodylate M (pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדגימות לתצפית מיקרוסקופית, כפי שדווח בעבר על ידי et al ריברה-N. 10 ולבחון באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בפוטנציאל חשמלי של 15 וולט ובהגדלה של 500X ו2000X. </li></ol> Assay הפצת נשק 6. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות תאים-דיסק המכילות 1.5 מיליליטר של מדיום התרבות, להוסיף 150 μl של צבען חיוני (AB) על פי הנחיות יצרן ולדגירת התאים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר התוספת של AB (0 שעה) וכל שעה 24 עד שמגיעים 7 ימים של תרבית תאים, למדוד את הספיגה ב 570 ננומטר עם אורך גל של 600 ננומטר התייחסות. </li></ol> 7. יחידת יצירת מושבה (CFU) 11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדיסקין תרבית רקמת 100 מ&quot;מ HG-DMEM תרבות 100 תאי דגירה של 14ימים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את התרבות עם PBS ואת הכתם עם 0.5% סגולים גביש במתנול למשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחות עם PBS פעמיים ולספור את המושבות הגלויות באמצעות hemocytometer. </li></ol>

<ol>
	<li>Alviano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Term+amniotic+membrane+is+a+high+throughput+source+for+multipotent+mesenchymal+stem+cells+with+the+ability+to+differentiate+into+endothelial+cells+in+vitro.">Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro.</a> BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).</li><li>Anker, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mesenchymal+stem+cells+of+fetal+or+maternal+origin+from+human+placenta.">Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.</a> Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).</li><li>Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+six+bone-graft+substitutes+regarding+to+cell+seeding+efficiency,+metabolism+and+growth+behaviour+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC)+in+vitro.">Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro.</a> Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).</li><li>Meseguer-Olmo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+kinematics+of+human+osteoblasts+on+porous+hydroxyapatite+ceramics.">In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics.</a> Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).</li><li>Fassina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-power+ultrasound+as+a+tool+to+culture+human+osteoblasts+inside+cancellous+hydroxyapatite.">Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite.</a> Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).</li><li>Fassina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+and+Electromagnetic+Enhancement+of+a+Culture+of+Human+SAOS-2+Osteoblasts+Seeded+onto+a+Titanium+Plasma-Spray+Surface.">Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).</li><li>Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+porosity+of+starch-based+fiber+mesh+scaffolds+on+the+proliferation+and+osteogenic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+cultured+in+a+flow+perfusion+bioreactor.">Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor.</a> Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).</li><li>Rodriguez-Fuentes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nukbone(R)+promotes+proliferation+and+osteoblastic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+amniotic+membrane.">Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).</li><li>Leyva-Leyva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesenchymal+stem+cell+subpopulations+from+human+amniotic+membrane+with+dissimilar+osteoblastic+potential.">Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential.</a> Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).</li><li>Rivera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blackwater+fever+like+in+murine+malaria.">Blackwater fever like in murine malaria.</a> Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).</li><li>Pochsmpally, R., Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Forming+Units+Assays+for+MSCs.">Colony Forming Units Assays for MSCs.</a> Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. , (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

תאי הגזע שנלקחו ממי שפיר קרום אנושי (איור 1) הראו מורפולוגיה כמו פיברובלסטים-, בדומה לתאי mesenchymal (איור 2) והיו בעיקר MSCs. בנוסף, cytometry זרימת מבחני גילו כי תאים אלה היו חיוביים לסמני תא mesenchymal (CD73, CD90, וCD105) ושליליים עבור סמני שושלת hematopoietic (CD34, CD45) (איור 3). כמו כן, AM-hMSCs מבודד בעבודה זו יציג את היכולת להרכיב CFUs (איור 6). בדומה לכך, תאי גזע mesenchymal המבודדים בצורה זו נשמרים היכולת לצרף לחומר ביולוגי osteoinductor (איור 4), ומתרבה על הפיגום (איור 5). מסיבות אלה, שיטת התרבות של AM-hMSCs על חומר ביולוגי עצם macroporous ששימשה בעבודה זו מהווה הזדמנות להכניס תאים בתוך רקמת עצם נפצעה ולגרום differentiation לשושלת osteoblastic. מערכת זו התרבות אינה דורשת תוספת של סלילי osteoblastic כדי לשמור על תהליך התמיינות פנוטיפ תא העצם וosteoblastic כי NKB הוא חומר andosteoinductive osteoconductive 8. השימוש ברקמות פסולת, כגון שליה אנושית, מייצג אלטרנטיבה פשוטה ואתית לגשת אוכלוסייה של תאי גזע בעלי הפוטנציאל להתמיין לתאי גזע, בהשוואה למקורות אחרים שלעתים קרובות כרוכים בשיטות פולשניות או תשואת תא נמוכה. שיטת התרבות המוצעת ניתן להסיק לin vivo מערכות, כי התאים הם זורעים במייקרו-מסה על חומר המשטח העליון, והתאים ליישב ולדבוק בכל פני השטח הביולוגי לאחר הפעמים הדגירה המתאימות. יתר על כן, חומרים כימיים, ציוד ונהלים מתוחכמים אינם נדרשים, בניגוד לשיטות קיימות בעת יישום טכניקה זו cultureas מיקרו-מסה ובתצהיר איטי ויציב של aliquot הסלולרי על החומר כדי להבטיח שהתאים מעדיפים אינטראקציה עם החומר הביולוגי, ולא עם החלק התחתון של הצלחת. עוד נקודה קריטית היא השימוש בחומר-רטוב מראש לפני culturing התאים, כמו זו מבטיחה כי התאים יצטרכו את חומרים מזינים הדרושים ממדיום התרבות כשהם משולבים בחומר ללא קשר אם הם על פני השטח או בתוך הנקבוביות. לבסוף, השימוש בחומר ביולוגי osteoinductive הוא קריטי לתהליך זה כי זה ימנע את התוספת של גורמים חיצוניים כדי לעורר ולשמור על בידול osteoblastic. המגבלה של השיטה היא שהיא מבוססת על פוטנציאל osteoinductive של מטריצת השור; עם זאת, במערכת התרבות המוצעת ניתן להסיק לכל חומר נקבובי עם הפצה נקבובית של 20 עד 200 מיקרומטר. לכן, ההליך שהוצג בעבודה זו היא שיטה אלטרנטיבית לculturing תאי גזע mesenchymal בt חומרים השוניםכובע מועסק להנדסת רקמות, במיוחד להתחדשות עצם.

יש לשייך והתחדשות של tissuesis אחד יעדי themain של מדע הרפואה כי נגע בororgan רקמה יכול להיות incapacitating ו, בחלק ממקרים, קטלני. בהקשר, עובדי מערכת הבריאות וחוקרים מחפשים כל הזמן טכניקות, שיטות וכלים כדי לספק alternativesto הטיפולי החדש לקדם תהליך התחדשות זוג-שם של רקמות פגועות. לכן, מדעים ביו-רפואיים התמקדו במחקר של תאי גזע mesenchymal (MSCs), במיוחד בתאי גזע בוגרים, כי שושלת תא זה מייצגת מודל אידיאלי ללמוד את תהליך התחדשות הרקמות, בשל הפוטנציאל שלה כדי לבדל לectodermal, mesodermal, וendodermal שושלות תאים עם זאת, כדי להפוך את הטיפול עם תאי גזע מציאות, אפיון פוטנציאל thetherapeutic של MSCs חייב להיות מלווה ביישום של טכניקות תרבית תאים חדשות באמצעות ביו-חומרים ופיגומים סלולריים המבטיחים את ההתנהגות הרצויה של MSCs ברקמת המארח. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; האתגר העיקרי להתגבר ביישום תרבות עם MSCs בהתחדשות עצם הוא להבטיח הידבקות תא על החומר ביולוגי שנבחר, אשר בדרך כלל מציג מבנה נקבובי עם adistribution נקבוביות הנע בין מיקרומטרים למילימטרים להיות מועסקת אבל לעתים קרובות דורש חומרים כימיים מתוחכמים, ציוד, ונהלים המשנים את התנהגותם של תאים. נהלים אלה מתאימים להערכה במבחנה, אך לא לניפוח והיישום במערכות פתוחות מורכבות, כגון אדם או במבחני vivo. טכניקות המתמקדות בהבטחת הידבקות תא לטופוגרפיות אקראיות, כגון חומרים נקבוביים עצם, נחקרו על ידי ההדבקה של החומר לתחתית בארות תרבות ומועסקות collagens ופולימרים agarose. לשיטות אלו, התאים שנזרעו על פני השטח נשמרו בנקבוביות ועל פני השטח העליונים. עם זאת, היבט זה לא ניתן להבטיח בin vivoמערכת, שבו נוזלי הגוף המקיפים את החומר הביולוגי יכולים לגרור את התאים מהאתר הרצוי על פיגומים נקבוביים היא השימוש בגירוי קולי, שדורש ציוד מתוחכם אבל מקדם את הביטוי של סמני osteoblastic במבחני חוץ גופית 5. השימוש בתרבויות רציפות דורשת bioreactors, אשר מבטיח הפצה הומוגנית של חומרים מזינים במדיום התרבות; עם זאת, אחוז משמעותי של התאים בתרבית הוא איבד בעת החלפת מדיום התרבות בשל קצב הזרימה המשמש בטכניקה זו והדבקות בינונית לקירות של הציוד. נושאים אלה מגדילים את המסה הסלולרית כי הוא הכרחי עבור סוג זה של התרבות והזמן להשגת מספר מספיק של תאים 7. לפיכך, המתודולוגיה שהוצגה בעבודה זו מייצגת טכניקה שצריכה להסיק לin vivo מערכות, כי התאים הם זורעים במייקרו-מסה על חומר משטח עליון, ולאחר נאות,אכלתי פעמים דגירה, 60% מהמסה הסלולרית הראשונית דבק. יתר על כן, טכניקה זו אינה דורשת תוספת של סלילי osteoblastic (למשל, dexamethasone, חומצה אסקורבית, או בטא-glycerophosphate) או גירויים קוליים כדי לגרום להתמיינות osteoblastic ותחזוקה של פנוטיפ תא העצם בגלל NKB היא osteoconductive ופיגומי osteoinductive 8, השיטה לתרבות של תאי גזע מהקרום מי שפיר האנושי (AM-hMSCs) על חומר ביולוגי עצם macroporous מוצג בrepresentsapossibility עבודה זו כדי להוסיף תאים לרקמת עצם פגוע ולגרום להתמיינות לשושלת osteoblastic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>sterile phosphate buffered saline</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10010023</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10378016</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>26140111</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11965118</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type II</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>17101015</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mM calcium chloride</td>
			<td>SIGMA_ALDRICH</td>
			<td>C5670</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/0.5mM EDTA solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>R001100</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC- CD90,</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD34</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CD45</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD105</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BD FACSCalibur</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue (AB)</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUNRISE-reader</td>
			<td>TECAN, Germany</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human mesenchymal stem cells and their cultivation on the porous bone matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

בידוד תאי גזע mesenchymal האדם לאחר הפרדה מכאנית של AM מהסיסי באמצעות לנתיחה בוטה (איור 1), אוכלוסיית תאים חסיד הייתה מתקבלת על ידי טריפסין וcollagenase השני עיכול. תא אוכלוסיות אלה מצורפים בצלחת תרבות presenta מורפולוגיה של תאים כמו פיברובלסטים-ב 3 ימי הודעה בידוד כפי שמוצגים במיקרוסקופ האופטי (איור 2 א) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 2) .the שליות משמשות בעבודה זו התקבלו מאמהות תורם בריאים withprevious הסכמה מהדעת. תא אפיון על ידי הזרימה cytometry אוכלוסיית התאים שהתקבלה מAM הייתה מאוד תגובתי לCD90 סמני mesenchymal המשטח + (93.5% ± 6.85) וCD73 + וCD105 + (79% ± 3.46) והראתה תגובה שלילית לסמני hematopoietic כגון CD34- וCD45. כך,AM-hMSCs משמש בעבודה זו היה mesenchymal, במידע שדווח בעבר על ידי accordancewith ייבה et al. (איור 3). בנוסף, תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מאפייני immunophenotype שהוקמו על ידי האגודה הבינלאומית לסלולרי Therapy (ISCT) לתאי גזע mesenchymal. תא הידבקות במטריצת עצם Micrographs הסריקה להראות ההתנהגות של AM-hMSCs שבעה הימים לאחר שכבות על NKB. פני השטח של החומר הביולוגי היה מכוסה בתאים כדוריים (יום אחד), וחלק מתאים מתפשטים כנראה מחוברים אל פני השטח מטריצת השור ביום השביעי. בהגדלה גבוהה יותר, התאים מתפשטים נראים בקשר הדוק באמצעות תהליכי filipodial (פל) (איור 4). תא התפשטות על מטריצת עצם התוצאות של assay AB הראו ירידה קטנה בספיגה היחסית u<html> nits (ראו) של מצב מטריצה ​​(+ מטריצת עצם) שור לאחר יום 1 של דגירה ולאחר מכן ביום החמישי, הנוכחות של הפיגום גורמת לעלייה בהתפשטות התאים מובהקת סטטיסטי בהשוואה לתרבות שבוצעה בהעדר השור מטריקס (Matrix -bone) (איור 5). יחידת יצירת מושבה CFU הוא assay מסורתי של תאי גזע. AM-hMSCs מבודד בעבודה זו נשמר יכולתה ליצור מושבות בדידות ב 14 ימים בתרבות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig1highres.jpg" /> איור 1: בידוד של קרום מי שפיר. () חבל הטבור (UC) מוחזק ביד אחת כדי לזהות את האזור שבו הקרום מי השפיר מתקבל. (ב) הקרום מי השפיר (AM) דומה סרט שקוף ללא עצבוב דם. ve_content &quot;fo: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig2highres.jpg" /> איור 2:. מאפיינים מורפולוגיים של תאי גזע מהקרום מי השפיר האנושי תרבויות AM-hMSC ב 3 ימים לאחר בידוד-נצפו באמצעות מיקרוסקופ אופטי והראו המורפולוגיה כמו פיברובלסטים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig3highres.jpg" /> איור 3:. Cytometry זרימת אפיון התאים מקרום מי שפיר אדם היו תאים בעיקר mesenchymal כי הם היו חיוביים לסמני mesenchymal (CD73, CD90, CD105), כפי שמוצגים על ידי התזוזה של היסטוגרמה לימין, ושלילי לסמני hematopoietic (CD34 וCD45), כפי שאושר על ידי התזוזה של היסטוגרמה לשמאל. אנטיגנים מוצגים בהיסטוגרמות אדומה, ואילו השליטה isotypesfor fluorochromes PE וFITC הם נצפו בשחור. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig4highres.jpg" /> איור 4:.. תא הידבקות במטריצת עצם שור סדרה של תמונות SEM מראים חיבור של התאים נקבוביות של החומר הביולוגי () חזון פנורמי של נקבובית NKB עם מספר תאים דבקו בחומר הביולוגי במדינה הכדורית (CS) ו שיטח (CF) על פני השטח של החומר הביולוגי, ניתן גם להעריך את העצם חסר מצביע על נקודות (Lac) בשלושה ימים של התרבות במטריצת השור. הגברה (B) של התא בתהליך של הסתגלות על פני השטח של החומר באמצעות תחזיות filipodial האינטראקציה (C) בין שני תאים דבקים ושטחו על מטריצת השור (C1, תא 1; וC2, תא 2).. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51999/51999fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי v</a>iew גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig5highres.jpg" /> איור 5:. התפשטות של תאים על התפשטות תאי עצם מטריצת שור הוערך על ידי הפחתת AB ובא לידי ביטוי ביחידות הספיגה היחסית לאורך 7 ימים של טיפוח. תוצאות מוצגות ההשפעה של מטריצת עצם (+ מטריצת עצם) בהתפשטות AM-hMSCs שהייתה שונה באופן סטטי בהשוואה למצב השלילי (-bone מטריצה). (* P &lt;0.05) <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig6highres.jpg" /> איור 6: assay CFU של MSCs תחילה מצופה בצפיפויות שונות וטופחו במשך 14 ימים (כלומר * / - SD, n = 10). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> תאים דבקים </td><td> הידבקות תא (%) </td></tr><tr><td> תאים בתחתית </td><td> 187,667 ± 1,208 </td><td> 62.47 </td></tr><tr><td> תאים על הפיגום </td><td> 312,333 ± 1,208 </td><td> 37.53 </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. יעילות של הידבקות במטריצת שור התאים דבקו בתחתית צלחת הצלחת והתאים הקפדה על הפיגום נספרה על ידי hemocytometer לאחר שהתאוששה על ידי trypsinization.The נתונים המוצגים בטבלה מתאים לשני ניסוי עצמאי לשלושה עותקים ± סטיית תקן

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix at JoVE.com

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...