Name: efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00
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We would like to acknowledge David O'Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren wurden nach den von der Animal Care und Verwenden Ausschuss empfahl der Johns Hopkins University Richtlinien durchgeführt. 1. Ahead of Time: Herstellung von Instrumenten, Reagenzien und Geschirr <ol><li> Herstellung der Eier: Inkubieren befruchteten White Leghorn Hühnereiern bei 37,5 ° C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit für 5 Tage in einem Brutkasten. HINWEIS: Ein Inkubator mit Schaukelkapazität kann hilfreich für die Standardisi...

<ol>
	<li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells:+a+novel,+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures.">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li><li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).</li><li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture.">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li><li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations:+characterization+and+partial+purification.">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li><li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li><li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+survival:+identification+of+RdCVF.">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li><li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEDGF:+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells.">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li><li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture.">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li><li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors.">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li><li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro.">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li><li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons.">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li><li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1.">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures:+Effects+of+PNPF,+a+substratum-bound,+neurite-promoting+factor.">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo.">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li><li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis.">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li><li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures.">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li><li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures.">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li><li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro:+analysis+with+the+'window-labeling'+technique.">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li><li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures.">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li><li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells.">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22 (2012).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+types+in+the+retina.">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li><li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro.">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li><li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies,+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor.">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li><li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation.">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li><li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation.">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li><li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures.">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).</li><li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures.">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li><li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro.">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li><li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transfected+genes+by+differentiated,+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures.">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li><li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells.">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li><li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS+vector+system.">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li><li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer.">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells.">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li></ol>

Der kritischste Schritt für den Erfolg dieses Protokolls ist die Auswahl des geeigneten Stadium der Embryonen. In früheren Veröffentlichungen wird ein Bereich von Embryonalstadien für diesen Kulturen gegeben, die typischerweise von den Tagen Inkubation oder embryonale Tage (ED) definiert sind; somit ist es in der Regel davon ausgegangen, dass die Verwendung von ED 5 bis ED 6 Embryonen zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Wir haben jedoch gefunden, dass auf der Bühne 27 (ED &amp; sub5;), wird die Transfektionseffi...

Dissoziierten Zellkulturen von embryonalen Hühnernetzhaut wurden allgemein verwendet, um verschiedene Aspekte der Photorezeptor Zellbiologie, einschließlich deren Überleben 2-9, Differenzierung 10-12, Neuritenwachstum 13 und mehr zu studieren. Die Vorteile dieses Systems, in den 1980er Jahren von Ruben Adler und Mitarbeiter entwickelt und von seinem und anderen Gruppen 14-20, perfektioniert liegen in den intrinsischen Eigenschaften des Kükens als Tiermodell 21. Die Größe des Hühnerauge, auch bei embryonalen Stadien, bietet große Mengen an Material für Kulturen. Außerdem, wenn Kulturen mit embryonalen Tag (ED) durchgeführt 5 - 6 Retinae, 55 - 80% ihrer Vorläuferzellen zu differenzieren, wie Photorezeptoren, 14,15,18,22,23, und da etwa 86% der Photorezeptoren in diesem Tier sind Kegel 24 sind diese Kulturen besonders geeignet für die Studien, die sich auf dieser Zelltyp. Wir haben vor kurzem developed und dadurch eine einfache Technik, die für hocheffiziente Plasmid Transfektion der Zellen in diesen Kulturen ermöglicht, wodurch die Erweiterung der Nützlichkeit dieses Systems durch Erleichterung genetische Studien missexpression 1. Die Entwicklung dieser Technik ergab sich aus einem Hohlraum in der wissenschaftlichen Literatur von Methoden, die ein akzeptables Niveau der Transfektion bereitstellen würde, um für die Untersuchung der Gen-Funktion in einer Zelle autonom zu ermöglichen. Dies ist zum Teil, weil primären neuronalen Kulturen sind notorisch schwer zu transfizieren 25,26. Einige der am häufigsten verwendeten Techniken, die zuvor für diesen Zweck zur Verfügung enthalten chemische Transfektionsverfahren wie Lipofektion oder Calciumphosphat-vermittelte Transfektion, die in Wirkungsgrade in der Grßenordnung von 3-5% führen und kann beträchtliche Toxizität 27-32 auszuüben. Obwohl die Verwendung von Plasmiden mit einem enzymatischen Reporter-Systems kann das Problem der schlechten Transfektionseffizienz durch Verstärken des Signals zu umgehen, sie nichtdiskriminieren zellspezifische Wirkungen, und ihre Ergebnisse werden auf einer kleinen Zellpopulation, die nicht repräsentativ für die gesamte erweisen. Eine andere weit verbreitete Methode in der Küken, RCAS Virus-Infektion, ist nur auf proliferierende Zellen anwendbar und somit nicht für diese primäre Netzhautkultursystem 33 geeignet ist. Im aktuellen Protokoll embryonalen Hühneraugen werden in Stadium 27 (ED &amp; sub5;), der retinalen Pigmentepithel (RPE) wird entfernt, und das Netzhautbecher in einer Elektroporationsküvette Kammer mit einem Plasmid enthaltenden Lösung gefüllt war enukleiert und Elektroporation mit maßgeschneiderten Elektroden, gefolgt von retinalen Dissoziation und Kultur unter Verwendung von Standardtechniken 21. Nach der Optimierung dieses Verfahrens waren wir, ohne die Überlebensrate und Differenzierungsmerkmale der Lage zu Transfektionseffizienzen erzielen durchweg in der Größenordnung von 22% der Gesamtzahl der Zellen in der Kultur und 25% innerhalb der Photorezeptorpopulation AlleinKulturen 1. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll umreißt alle wichtigen Schritte dieses Verfahrens, um den Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieser Technik zu gewährleisten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electro Square Porator</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0115 model 512</td>
			<td>Gold tipped electrode used as anode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide Tubing</td>
			<td>Vention Medical</td>
			<td>custom made</td>
			<td>Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm square box filament, 4.5mm wide</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB245B</td>
			<td>Used to make cathode electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco - Life Technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td>Serrated; Slight Curve; 4.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers 5/45</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td>Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps, 1x2 teeth</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75&#34; Length; .3mm Tip Width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach

Die Kegelphotorezeptor-angereicherten Kulturen von embryonalen Hühnernetzhaut abgeleitet sind zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Forscher auf der ganzen Welt das Studium der Biologie der Netzhautneuronen, insbesondere Photorezeptoren. Die Anwendungen dieses Systems gehen über die Grundlagenforschung, da sie leicht zu Hochdurchsatztechnologien zur Wirkstoffentwicklung angepasst werden. Jedoch genetische Manipulation von retinalen Photorezeptoren in diesen Kulturen hat sich als sehr schwierig, sie eine erhebliche Einschränkung für die Nützlichkeit des Systems. Wir haben vor kurzem entwickelt und validiert eine ex ovo Plasmid Elektroporationstechnik die die Rate der Transfektion von Retinazellen in diesen Kulturen erhöht durch das Fünffache im Vergleich zu anderen gegenwärtig verfügbaren Protokolle 1. Bei diesem Verfahren embryonalen Hühneraugen an Stufe 27 ausgeschält, die RPE wird entfernt, und das Netzhautbecher wird in einem Plasmid-haltigen Lösung gegeben und elektroporiert Verwendung einfach aufgebaut Kundenhergestellten Elektroden. Die Netzhaut werden dann dissoziiert und kultiviert Verwendung von Standardverfahren. Diese Technik kann durch die Verwendung von Plasmid-driven RNAi-Technologie zu Expressionsstudien sowie zu der Herunterregulierung der Genexpression verwendet werden, zum Beispiel, allgemein erzielen die Transgen-Expression in 25% der Photorezeptorpopulation. Das Videoformat der vorliegenden Veröffentlichung wird diese Technologie leicht zugänglich für Forscher auf dem Gebiet zu machen, so dass die Untersuchung von Gen-Funktion in der primären Netzhautkulturen. Wir haben auch detaillierte Erläuterungen der kritischen Schritte dieses Verfahrens für ein erfolgreiches Ergebnis und Reproduzierbarkeit.

Hier präsentieren wir ein einfaches Protokoll für Plasmidtransfektion in entkernte Küken Netzhautbecher für nachfolgende dissoziierten Zellkultur. Transfektion durch Elektroporation unter Verwendung einfach individuelle Elektroden (- 2 Die Zahlen 1) Nutzen erzielt. Die in diesem Protokoll beschriebenen Parameter optimiert wurden Transfektionseffizienzen zwischen 20 und 27% (mit einem Durchschnitt von 22%) (Figur 3D) Bereich zu erhalten. Bemerken, dass bei den oben genannten Gründen...

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...