Name: efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach
Uploaded: 2015-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach at JoVE.com

We would like to acknowledge David O'Brien for his support with data analysis, and all the members of the Canto-Soler lab for their critical discussions. This work was supported by NIH grants EY004859 and EY022631 (MVCS), Core Grant EY1765, and an unrestricted departmental grant from Research to Prevent Blindness, Inc.

Alle prosedyrer beskrevet i dette arbeidet ble utført i henhold til retningslinjene som er anbefalt av Animal Care og bruk komité ved Johns Hopkins University. 1. Ahead of Time: Utarbeidelse av instrumenter, reagenser og Dishes <ol><li> Fremstilling av egg: Inkuber befruktede hvite Leghorn kyllingegg ved 37,5 ° C og 60% relativ fuktighet i 5 dager i en inkubator egg. MERK: En inkubator med gynge kapasitet kan være nyttig for å standardisere og synkronisering av embryoutvikling,...

<ol>
	<li>Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+electroporation+of+retinal+cells:+a+novel,+high+efficiency+method+for+functional+studies+in+primary+retinal+cultures.">Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures.</a> Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).</li><li>Chalmel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).</li><li>Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+photoreceptor+survival+in+embryonic+chick+retinal+cell+culture.">Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture.</a> J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).</li><li>Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+survival-promoting+activity+in+interphotoreceptor+matrix+preparations:+characterization+and+partial+purification.">Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification.</a> Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).</li><li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36, 755-759 (2004).</li><li>Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+survival:+identification+of+RdCVF.">Cone survival: identification of RdCVF.</a> Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).</li><li>Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEDGF:+survival+of+embryonic+chick+retinal+photoreceptor+cells.">LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).</li><li>Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+regulates+the+survival+of+avian+retinal+neurons+and+photoreceptors+in+culture.">Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture.</a> Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).</li><li>Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+effects+in+purified+cultures+of+chick+embryo+retina+neurons+and+photoreceptors.">Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).</li><li>Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+promotes+chick+photoreceptor+development+in+vitro.">Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro.</a> Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).</li><li>Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+homeobox+genes+on+the+differentiation+of+photoreceptor+and+nonphotoreceptor+neurons.">Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).</li><li>Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-photoreceptor+activity+of+chick+neurogenin1.">Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neurite+growth+in+purified+retina+neuronal+cultures:+Effects+of+PNPF,+a+substratum-bound,+neurite-promoting+factor.">Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor.</a> J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+retinal+cell+differentiation+in+the+chick+embryo.">A model of retinal cell differentiation in the chick embryo.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).</li><li>Adler, R., Hatlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+differentiation+of+embryonic+retinal+cells+after+terminal+mitosis.">Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis.</a> Science. 243 (4889), 391-393 (1989).</li><li>Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cone-like+properties+by+chick+embryo+neural+retina+cells+in+glial-free+monolayer+cultures.">Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).</li><li>Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+cytochemical+identification+of+neuronal+and+non-neuronal+cells+in+chick+embryo+retina+cultures.">Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).</li><li>Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+terminal+mitosis+and+differentiated+fate+of+retinal+precursor+cells+in+vivo+and+in+vitro:+analysis+with+the+'window-labeling'+technique.">Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique.</a> Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).</li><li>Hyndman, A. G., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retina+development+in+vitro.+Effects+of+tissue+extracts+on+cell+survival+and+neuritic+development+in+purified+neuronal+cultures.">Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures.</a> Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).</li><li>Politi, L. E., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+enriched+populations+of+cultured+photoreceptor+cells.">Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Dev. 7, 22 (2012).</li><li>Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+types+in+the+retina.">Determination of cellular types in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).</li><li>Repka, A., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+retinal+precursor+cells+born+in+vitro.">Differentiation of retinal precursor cells born in vitro.</a> Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).</li><li>Morris, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetry+in+a+receptor+mosaic+demonstrated+in+the+chick+from+the+frequencies,+spacing+and+arrangement+of+the+types+of+retinal+receptor.">Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor.</a> J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).</li><li>Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+rat+brain+cells+by+electroporation.">Transfection of rat brain cells by electroporation.</a> J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).</li><li>Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+primary+central+and+peripheral+nervous+system+neurons+by+electroporation.">Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation.</a> Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).</li><li>Boatright, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+flanking+regions+of+IRBP+and+arrestin+have+promoter+activity+in+primary+embryonic+chicken+retina+cell+cultures.">The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures.</a> Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).</li><li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bZIP+transcription+factor+Nrl+stimulates+rhodopsin+promoter+activity+in+primary+retinal+cell+cultures.">The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures.</a> J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).</li><li>Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-mediated+gene+transfection+into+chick+embryo+retinal+cells+in+ovo+and+in+vitro.">Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).</li><li>Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transfected+genes+by+differentiated,+postmitotic+neurons+and+photoreceptors+in+primary+cell+cultures.">Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures.</a> J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).</li><li>Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+PRPF31+inhibit+pre-mRNA+splicing+of+rhodopsin+gene+and+cause+apoptosis+of+retinal+cells.">Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells.</a> J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).</li><li>Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS+vector+system.">The RCAS vector system.</a> Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).</li><li>Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gene+promoters+for+liver+expression+by+hydrodynamic+gene+transfer.">Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer.</a> J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CMV-beta-actin+promoter+directs+higher+expression+from+an+adeno-associated+viral+vector+in+the+liver+than+the+cytomegalovirus+or+elongation+factor+1+alpha+promoter+and+results+in+therapeutic+levels+of+human+factor+X+in+mice.">CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).</li><li>You, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+promoter-containing+vector+for+direct+cloning+and+enhanced+expression+of+PCR-amplified+ORFs+in+mammalian+cells.">A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells.</a> Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).</li></ol>

Den mest kritiske trinnet for å lykkes med denne protokollen er å velge riktig stadium av embryoene. I tidligere publikasjoner, er en rekke av embryonale stadier gitt for disse kulturene, typisk definert av dagers inkubasjon eller embryoniske dager (ED); dermed er det vanligvis antatt at bruk av ED 5 til ED 6 embryo vil gi tilsvarende resultater. Men vi har funnet ut at på scenen 27 (ED 5), vil transfeksjonseffektivitet være rundt 22% av den totale cellepopulasjonen, som nevnt ovenfor; men effektiviteten vil reduser...

Dissosierte cellekulturer fra embryonale chick netthinne har blitt mye brukt til å studere ulike aspekter av fotoreseptoren cellebiologi, inkludert deres overlevelse 2-9, differensiering 10-12, neurittutvekst 13, og mer. Fordelene med dette systemet, utviklet på 1980-tallet av Ruben Adler og medarbeidere og perfeksjonert av hans og andre grupper 14-20, bor i de iboende egenskapene til dama som en dyremodell 21. Den store størrelsen på chick øyet, selv på embryonale stadier, gir store mengder materiale for kulturer. Videre, når kulturene blir utført ved hjelp av embryonale dag (ED) 5 - 6 netthinne, 55 - 80% av deres forløperceller skille som fotoreseptorene 14,15,18,22,23, og siden ca 86% av fotoreseptorene i dette dyret er kjegler 24, disse kulturene er spesielt egnet for studier som fokuserer på denne celletype. Vi har nylig utvikledeped og karakterisert en enkel teknikk som gjør det mulig for høyeffektiv plasmid transfeksjon av cellene i disse kulturene, og dermed utvider nytten av dette systemet ved å tilrettelegge for genetisk missexpression studie 1. Utviklingen av denne teknikken stammet fra et hulrom i den vitenskapelige litteratur metoder som ville gi et akseptabelt nivå av transfeksjon for å muliggjøre studier av genfunksjon i en celle autonom måte. Dette er delvis fordi primære nevrale kulturer er notorisk vanskelig å transfektere 25,26. Noen av de mest brukte teknikker som tidligere har vært tilgjengelig for dette formålet inkluderte kjemiske transfeksjonsmetoder så som lipofeksjon eller kalsiumfosfat-mediert transfeksjon, noe som resulterer i effektivitet i størrelsesorden 3-5%, og kan utøve betydelig toksisitet 27-32. Selv om bruken av plasmider med en enzymatisk rapportørsystem kan omgå problemet med dårlig transfeksjonseffektivitet ved å forsterke signalet, de ikkediskriminere celle-spesifikke effekter, og deres resultater er basert på en liten cellepopulasjon som kanskje ikke er representative for hele. En annen mye brukt metode i kylling, RCAS virusinfeksjon, gjelder bare for prolifererende celler, og dermed ikke er egnet for denne primær retinal kultursystem 33. I den nåværende protokoll embryoniske kylling øyne er enucleated ved trinn 27 (ED 5), retinal pigmentert epitel (RPE) er fjernet, og retinal koppen plasseres i en electroporation kammer fylt med et plasmid inneholdende oppløsning og elektroporert ved bruk av skreddersydde elektroder, etterfulgt av retinal dissosiasjon og kultur ved bruk av standard teknikker 21. Etter optimalisering av denne fremgangsmåten har vi vært i stand til konsekvent å oppnå transfeksjonseffektivitet i størrelsesorden 22% av det totale antall celler i kultur og 25% i løpet av fotoreseptoren populasjon alene, uten at overlevelsen og differensierings egenskaper avkulturer 1. Her har vi tilveiebringe en detaljert protokoll som beskriver alle de viktige trinnene i denne fremgangsmåten for å sikre suksess og reproduserbarheten av denne teknikk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ECM 830 Electro Square Porator</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip</td>
			<td>BTX/ Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0115 model 512</td>
			<td>Gold tipped electrode used as anode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide Tubing</td>
			<td>Vention Medical</td>
			<td>custom made</td>
			<td>Internal Diameter: 0.5mm / wall thickness: 0.15-0.2mm. Used for insulating gold tiped electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5mm square box filament, 4.5mm wide</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>FB245B</td>
			<td>Used to make cathode electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco - Life Technologies</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moloney forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td>Serrated; Slight Curve; 4.5&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers 5/45</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td>Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn micro forceps, 1x2 teeth</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>Tying Platform; 1X2 Teeth, 0.12mm Teeth; 3.75&#34; Length; .3mm Tip Width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient gene transfer in chick retinas for primary cell culture studies: an ex-ovo electroporation approach

Kjeglen fotoreseptorlidelser-beriket kulturer avledet fra embryonale chick netthinne har blitt et uunnværlig verktøy for forskere rundt om i verden som studerer biologi netthinnens nerveceller, spesielt fotoreseptorer. Anvendelsen av dette system går utover grunnleggende forskning, da de lett kan tilpasses til høy gjennomstrømning teknologier for legemiddelutvikling. Imidlertid har genetisk manipulering av retinale fotoreseptorer på disse kulturene vist seg å være meget krevende, utgjør en viktig begrensning for nytten av systemet. Vi har nylig utviklet og validert en ex ovo plasmid elektroporering teknikk som øker frekvensen av transfeksjon av netthinneceller på disse kulturene ved fem ganger sammenlignet med andre for tiden tilgjengelige protokoller 1. I denne fremgangsmåten embryoniske kylling øyne er enucleated i trinn 27, RPE er fjernet, og retinal koppen plasseres i en plasmid-inneholdende oppløsning og elektroporert ved hjelp av lett konstrueres Custom-laget elektroder. Netthinne blir deretter dissosiert og dyrkes ved hjelp av standardprosedyrer. Denne teknikken kan brukes til overekspresjon studier samt til nedregulering av genekspresjon, for eksempel ved bruk av plasmid-drevet RNAi-teknologi, vanligvis oppnå transgene ekspresjon i 25% av populasjonen fotoreseptoren. Videoformatet av foreliggende publikasjonen vil gjøre denne teknologien lett tilgjengelig for forskere på feltet, slik at studiet av gen-funksjon i grunnskolen netthinnens kulturer. Vi har også tatt med detaljerte forklaringer av de kritiske trinnene i denne fremgangsmåten for et vellykket resultat og reproduserbarhet.

Her presenterer vi en enkel protokoll for plasmid transfeksjon inn erte utskrapte chick netthinnens kopper for påfølgende dissosiert cellekultur. Transfeksjon blir oppnådd ved elektroporering ved å bruke enkle å lage tilpassede elektroder (figurene 1 - 2). Parametrene som er beskrevet i denne protokoll har blitt optimalisert for å oppnå transfeksjonseffektiviteter som varierer mellom 20 og 27% (med et gjennomsnitt på 22%) (Figur 3D). Legg merke til at, av de grunner som er angit...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach at JoVE.com

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryoniske kylling retinal cellekulturer utgjør verdifulle verktøy for å studere fotoreseptoren biologi. Vi har utviklet en effektiv genoverføring teknikk basert på ex ovo plasmid elektroporering av netthinne før kultur. Denne teknikken øker betydelig i løpet av transfeksjonseffektivitet for tiden tilgjengelige protokoller, slik genetisk manipulasjon mulig for dette systemet.

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimalisert<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrking av Chick embryoer til avanserte stadier av utvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Culture of Embryonale Mus Cochlea eksplanter og Gene Transfer ved Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic Approach for Assessing Dannelse av nevronkoblinger i en Co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Â A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetisk tilnærming til Avdekke Stress resistensgener i Mus - En High-throughput Screen i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex vivo Culture of Chick lillehjernen Slices og Romlig Målrettet Electroporation av granulat Cell Forstadier

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer inn i Chicken hørbar Organ av<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

En novelle<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding Technique Alter Intrakardial hemodynamikken i en Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Et enzym og Serum-free Neural Stem Cell Culture Modell for EMT Investigation Egnet for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En Submerged filterpapir Sandwich for Long-term<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging of Early kyllingfoster

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Hele-celle Patch-clamp Opptak av isolerte primære epitelceller fra epididymene

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...