Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af NIH 4R00HL094708-03, MCW Research Affairs Committee nye fakultet Award, og Kern Foundation (startup midler) ved Medical College of Wisconsin (RLG); Rådets Forskningsbevillinger Hongkong Tema-baserede Afprøvning T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, og AHA Grundlagt Investigator Award (JCW); AHA Postdoc Fellowship 12POST12050254 (PWB). Vi takker Hope Campbell ved flowcytometri Kerne af blodet Research Institute of Wisconsin for at få hjælp med dataindsamling og omhyggelig gennemgang af manuskriptet.

1. Løsning og medier Forberedelse <ol><li> embryonale Kvalificeret Matrix Coating stamopløsning <ol><li> Langsomt tø embryonale kvalificeret matrix (5 ml) på is ved 4 * C natten over. Dispensere portioner i nedkølede, 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør og straks opbevares ved -20 ° C. BEMÆRK: rumfang af prøve vil variere baseret på parti og ligger typisk i området fra 270 til 350 pi. Producent giver oplysninger om mængden af ​​prøve kræves for at opnå en 1x koncentration efter fortynding i 25 ...

Afgørende for succes af differentiering protokollen er brugen af ​​høj kvalitet kulturer af hPSCs der er blevet passeret på enkelt celle niveau i mindst fem passager før starten af ​​differentiering. Lignende differentiering effektivitet rutinemæssigt observeret blandt forskellige hPSC rækker, hvis de er 100% sammenflydende ved starten af ​​differentieringen, uafhængig cellelinje. Observeres suboptimalt effektivitet, hvis sammenløbet af celler ved starten af ​​differentieringen er ≤95% eller&gt...

Produktion af kardiomyocytter fra hPSCs, herunder embryonale og hiPSC, kan fungere som en in vitro model af meget tidlige humane kardiale udviklingsprocesser, som giver indsigt i etaper ellers ikke har adgang til mekanistiske undersøgelser. Denne model system giver enestående muligheder for at studere de molekylære veje, der styrer kardiel afstamning engagement og celle skæbne specifikation. I de senere år har evne til effektivt at generere cardiomyogenic celler fra hPSCs forbedret 1-15. Men blandt protokoller er cellelinje variation med hensyn til effektivitet i at generere cardiomyogenic celler og timing, ved hvilken cellerne udtrykker kammer-specifikke markører (f.eks ventrikel og atria). Ideelt for fremtidige anvendelser af denne model system mere homogene populationer af funktionelt definerede celler ønskes. I modsætning til tidligere metoder, den cardiomyocyte differentiering protokollen beskrevet her kræver ikke cell sammenlægning eller tilsætningen af ​​Activin A eller knoglemorfogenprotein 4 (BMP4) og håndfast genererer kulturer yderst positivt for TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v og MLC2a ved dag 10 celler i hele testet til dato alle hESC og hiPSC linjer. Strategien er teknisk enkel at gennemføre, især i forhold til tre-dimensionelle kulturer, massekultur eller embryoid krop baserede strategier 4-9, og blev for nylig defineret i en undersøgelse, der beskriver et lille molekyle med selektiv toksicitet for hPSCs (Boheler et al. ) 65. Funktioner i denne protokol omfatter differentiering af hPSCs i monolagskultur hjælp af et enkelt lag af en hESC kvalificeret matrix (Matrigel), fuldt definerede medier ved hjælp af små molekyler til at modulere Wnt signalering (ligner, men alligevel adskiller sig fra 1,2,7,13), og optimeret flowcytometri farvning metoder til evaluering af differentiering effektivitet og celle identitet. Sammenfattende fordele ved denne protokol i forhold til tidligere rapporter omfatter sin cost-virkningsfuldeness, reproducerbarhed, og den høje effektivitet til at generere kardiomyocytter blandt flere hPSC linjer, herunder hESC og hiPSC linjer. Flowcytometri er et stærkt analytisk værktøj til at vurdere kvaliteten af ​​celler i kultur og fastlæggelse delpopulation homogenitet, og med korrekt eksperimentelt design, kan give kvantitative målinger. Som med alle antistof-baserede strategier, præcis fortolkning af forsøgsresultater kræver, at elementer af analysen design, herunder antistof koncentration og fiksering og permeabilisering forhold (når målretning intracellulære antigener) omhyggeligt testes for hvert antistof som sub-optimale forhold påvirker effektiviteten af ​​antistof signifikant binding, og derfor fortolkning af resultaterne. Vigtigere er det, hvis kvantificering er påkrævet, monoklonale antistoffer er af afgørende betydning, som polyklonale antistoffer kan genkende flere epitoper og er tilbøjelige til batch-til-batch-variation. I øjeblikket, en række af antistoffer (polyclonal og monoklonale) og farvningsprotokoller er blevet beskrevet til vurdering af in vitro-differentiering, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne effektiviteten af cardiomyogenesis blandt protokoller 1,2,9,11. Derfor anvendes monoklonale antistoffer, når tilgængelige for alle flowcytometri analyser. Fremadrettet forventes det, at standardisering af disse farvningsprotokoller, især med hensyn til kvantificering bør bedre muliggøre sammenligning mellem differentiering strategier. Valget af markører, og deres tilsvarende antistoffer, anvendes til at vurdere renheden af in vitro-cardiomyogenesis varierer blandt rapporter. TNNT2 er blevet betragtet som en indikator af celler forpligtet til cardiomyogenic skæbne og anvendes rutinemæssigt til at vurdere effektiviteten af ​​hjerte differentiering protokoller. Dog er TNNT2 også til udtryk i skeletmuskulatur under tidlig kylling og rotte udvikling 16,17, og det er til stede i human glat muskel 18 </sup&gt;. Således TNNT2 ikke nødvendigvis er en specifik markør for menneskelige cardiomyogenesis in vitro. MLC2v og MLC2a anvendes rutinemæssigt som surrogat markører for ventrikulær og atrial undertyper hhv. Men udfordringer med at stole på MLC2v og MLC2a at bestemme cardiomyocyte undertype i forbindelse med in vitro-differentiering skyldes, at disse genprodukter ikke kan være begrænset til en bestemt kammer hele kardiel udvikling, fra hjerte rør gennem voksen. I gnaver loopes hjerte, MLC2a mRNA er fremherskende i atriale / tilstrømning tarmkanalen område og MLC2v mRNA er fremherskende i ventrikel / udstrømning tarmkanalen regioner. I loopes hjerte, er co-ekspression af MLC2a og MLC2v mRNA&#39;er observeret i tilgangen tarmkanalen, atrioventrikulær kanalen, og udstrømningen tarmkanalen 19,20. Ved 3 dage efter fødslen, MLC2v mRNA begrænset til ventriklen og 10 dage efter fødslen, MLC2a begrænset til atrierne i den neonatale rotte hjerte 19. Derfor fortolkningaf data vedrørende cardiomyogenesis effektivitet og subtype identitet skal ikke kun overveje tilstedeværelsen og mængden af ​​referencemarkør niveauer, men skal overveje udviklingsstadiet (r), som tidspunkter af differentiering, der analyseres svarer. Dette er især vigtigt i betragtning af at modning fase af cardiomyogenic celler frembragt ved in vitro differentiering af hPSCs ligner nærmest de embryonale / føtale udvikling 21-25. Således bygger på en markør rumlige udtryk i den postnatale hjerte kan ikke være hensigtsmæssigt for vurderingen af ​​hPSC-afledte celler, i det mindste i nogle tilfælde. I et forsøg på at fremme udviklingen af mere specifikke kriterier for cardiomyocyte identitet in vitro, er TNNI3 anses for at være en værdifuld markør for at vurdere cardiomyogenesis in vitro som det er begrænset til hjertemusklen hele embryogenese i kylling og zebrafisk 15,20og er fraværende i human føtal skeletmuskel 26. Mens TNNI1 er til stede i human føtal hjerte, TNNI3 er den eneste TNNI isoform til stede i normalt voksent hjerte 27,28. Vedrørende cardiomyocyte undertype identitet, IRX4 29-31 er en informativ markør for celler med en ventrikulær skæbne. På proteinniveauet IRX4 nylig blevet vist at være begrænset til ventriklen fra lineære hjerte røret gennem neonatale stadier i musen 32. Følgelig er optimeret farvningsprotokoller til analyse af TNNI3 og IRX4 ved flowcytometri beskrevet. Til vores viden, er dette den første beskrivelse af en fremgangsmåde til effektiv antistof-baserede farvning og analyse af IRX4 niveauer i humane cardiomyocytter ved flowcytometri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

Der er et presserende behov for at udvikle metoder til at reparere det beskadigede hjerte, opdager nye terapeutiske lægemidler, der ikke har toksiske virkninger på hjerte, og forbedre strategier til nøjagtigt modellere hjertesygdomme. Potentialet for at udnytte menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC) teknologi til at generere hjertemuskulatur &quot;i en skål&quot; for disse applikationer fortsætter med at generere høj entusiasme. I de senere år har mulighed for effektivt at generere cardiomyogenic celler fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) stærkt forbedret, tilbyder os nye muligheder for at modellere meget tidlige stadier af menneskets kardiel udvikling ellers ikke har adgang. I modsætning til mange tidligere fremgangsmåder er cardiomyocyte differentiering protokollen beskrevet her kræver ikke celleaggregering eller tilsætning af activin A eller BMP4 og robust genererer kulturer af celler, der er yderst positivt for kardial troponin I og T (TNNI3, TNNT2) iroquois- klasse homeodomænet proteinIRX-4 (IRX4), myosin regulerende let kæde 2, ventrikulær / hjertemuskulaturen isoform (MLC2v) og myosin regulerende let kæde 2, atrial isoform (MLC2a) på dag 10 på tværs af alle humane embryonale stamceller (embryonale) og hiPSC linjer testet dato. Celler kan passeres og opretholdt i mere end 90 dage i kultur. Strategien er teknisk enkel at gennemføre og omkostningseffektive. Karakterisering af cardiomyocytter stammer fra pluripotente celler ofte omfatter analyse af referencemarkører, både mRNA og proteinniveauet. Til proteinanalyse, flowcytometri er et kraftfuldt analytisk værktøj til vurdering af kvaliteten af ​​celler i kultur og bestemme underpopulation homogenitet. Dog kan teknisk variation i prøveforberedelse væsentlig indflydelse kvaliteten af ​​flowcytometri data. Derfor bør standardisering af farvningsprotokoller lette sammenligninger mellem forskellige differentiering strategier. Derfor optimeret farvningsprotokoller til analyse af IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 og TNNT2 ved flowcytometri er beskrevet.

På dag 0 celler er 100% sammenflydende kompakt morfologi og minimal cellerester. På dagene 1-2, er det almindeligt at observere en betydelig celledød (40-50%), men vedhæftede celler bevarer kompakt morfologi (figur 1A). I løbet af denne tid, medier er orange og grumset. Pink medier indikerer overdreven celledød, og i dette tilfælde, og bekræft med trypanblåt og afbryde hvis celledød overstiger 70%. Celler vil komme i løbet af dag 3-4 og densitet vil stige. Under dage 5-6, forekommer minimal c...

Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Artiklen beskriver den detaljerede metode til effektivt at differentiere humane pluripotente stamceller til kardiomyocytter ved selektivt at modulere Wnt vej, efterfulgt af flowcytometri analyse af referencemarkører at vurdere homogenitet og identitet af befolkningen.

High Efficiency Differentiering af humane pluripotente stamceller til hjertemuskelceller og karakterisering ved hjælp af flowcytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Udledning af menneskelige Hjerte prækursorer og cardiomyocytter fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse af Cellesuspensioner isoleret fra Solid Væv af Spectral flowcytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Høj overførselshastighed måling af Dictyostelium discoideum Macropinocytosis af Flow flowcytometri

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Måling af mitokondriel masse og membran potentiale i hæmatopoietiske stamceller og T-celler ved flow cytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Enkelt ekstracellulær vesikel transmembranproteinkarakterisering ved nano-flowcytometri

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...