Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

Cette recherche a été financée par le NIH 4R00HL094708-03, MCW Affaires de recherche Nouveau Comité Faculty Award, et la fondation Kern (fonds de démarrage) au Medical College of Wisconsin (RLG); Conseil des subventions de recherche de base-Thème Hong Kong programme de recherche et T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, et AHA Créé bourse de chercheur (JCW); AHA postdoctorale 12POST12050254 (PTB). Nous remercions l&#39;espoir Campbell à la cytométrie en flux de base de l&#39;Institut de recherche de sang de Wisconsin pour l&#39;aide à la collecte de données et un examen attentif du manuscrit.

1 Solution et préparation des médias <ol><li> CSEh Matrice qualifié revêtement Stock Solution <ol><li> Lentement dégeler CSEh matrice qualifié (5 ml) sur la glace à 4 ° C pendant la nuit. Distribuer aliquotes dans des tubes à centrifuger pré-réfrigérés, 1,5 ml stérile et stocker immédiatement à -20 ° C. REMARQUE: Le volume de l&#39;aliquote varie en fonction de beaucoup et se situe typiquement 270-350 pi. Le fabricant fournit des détails concernant le volume de la portion aliquote nécessaire ...

Critique pour la réussite du protocole de différenciation est l&#39;utilisation de cultures de haute qualité de hPSCs qui ont été soumises à un passage à niveau de la cellule unique pendant au moins cinq passages avant le début de la différenciation. Différenciation efficacités similaires sont fréquemment observés chez les diverses lignes HPSC si elles sont confluentes à 100% au début de la différenciation indépendante de la lignée cellulaire. Efficacité sous-optimale est observée si la confluence de...

La génération de cardiomyocytes de hPSCs, y compris les CSEh et hiPSC, peut fonctionner comme un modèle in vitro de processus de développement cardiaques humaines très tôt, donnant un aperçu des étapes pas autrement accessibles pour des études mécanistiques. Ce système de modèle offre des opportunités uniques pour étudier les mécanismes moléculaires qui contrôlent l&#39;engagement de la lignée cardiaque et la spécification du destin cellulaire. Au cours des dernières années, la capacité à générer de manière efficace à partir de cellules cardiomyogéniques hPSCs a grandement amélioré 1-15. Cependant, parmi les protocoles il existe une variation de la ligne de cellule par rapport à l&#39;efficacité dans la production de cellules et cardiomyogéniques synchronisation à laquelle les cellules expriment des marqueurs spécifiques de la chambre (par exemple, le ventricule et oreillettes). Idéalement, pour des applications futures de ce système modèle, les populations plus homogènes de cellules fonctionnellement définies sont souhaitées. Contrairement aux procédés précédents, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas CEagrégation ll ou l&#39;ajout d&#39;activine A ou protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et robuste génère cultures très positif pour TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v, et MLC2a par jour 10 cellules dans toutes les lignées de CSEh et hiPSC testés à ce jour. La stratégie est techniquement simple à mettre en œuvre, en particulier par rapport à des cultures tridimensionnelles, la culture de masse, ou des stratégies fondées corps embryoïdes 4-9, et a récemment été définie dans une étude qui décrit une petite molécule à une toxicité sélective pour hPSCs (Boheler et al. ) 65. Caractéristiques de ce protocole comprennent la différenciation des hPSCs en culture monocouche à l&#39;aide d&#39;une seule couche d&#39;une matrice qualifié CSEh (Matrigel), milieux entièrement définis à l&#39;aide de petites molécules pour moduler la signalisation Wnt (semblable, mais distinct de 1,2,7,13), et flux optimisé cytométrie méthodes de coloration pour l&#39;évaluation de l&#39;efficacité de la différenciation et de l&#39;identité de la cellule. En résumé, les avantages de ce protocole par rapport aux rapports précédents comprennent son coût effectivEness, reproductibilité, et sa grande efficacité pour générer des cardiomyocytes entre plusieurs lignes HPSC, y compris les lignées de CSEh et hiPSC. La cytométrie en flux est un outil d&#39;analyse puissant pour évaluer la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogénéité, et avec un design expérimental approprié, peut fournir des mesures quantitatives. Comme pour toutes les stratégies à base d&#39;anticorps, l&#39;interprétation exacte des résultats expérimentaux nécessite que les éléments de la conception de l&#39;essai, y compris la concentration d&#39;anticorps et de la fixation des conditions de perméabilisation (lorsque ciblant des antigènes intracellulaires) sont soigneusement testés pour chaque anticorps comme des conditions sous-optimales affectent de manière significative l&#39;efficacité de l&#39;anticorps la liaison, et par conséquent, l&#39;interprétation des résultats. Il est important, si la quantification est nécessaire, les anticorps monoclonaux sont indispensables, comme les anticorps polyclonaux peuvent reconnaître des epitopes multiples et sont sujettes à des variations de lot à lot. Actuellement, une variété d&#39;anticorps (polyclonal protocoles et monoclonaux) et de coloration ont été décrits pour l&#39;évaluation de la différenciation in vitro, ce qui rend difficile la comparaison de l&#39;efficacité des protocoles cardiomyogenesis parmi 1,2,9,11. Pour cette raison, les anticorps monoclonaux sont utilisés lorsqu&#39;ils sont disponibles pour toutes les analyses de cytométrie en flux. À l&#39;avenir, il est prévu que la normalisation de ces protocoles de coloration, en particulier en ce qui concerne la quantification, devrait permettre une meilleure comparaison entre les stratégies de différenciation. Le choix des marqueurs et leurs anticorps correspondants, utilisé pour évaluer la pureté de in vitro cardiomyogenèse varie selon les rapports. TNNT2 a été considéré comme un indicateur de cellules engagées au sort cardiomyogénique et est couramment utilisée pour évaluer l&#39;efficacité des protocoles de différenciation cardiaques. Cependant, TNNT2 est également exprimée dans le muscle squelettique au cours de poussin et le développement du jeune rat 16,17 et il est présent dans le muscle lisse humain 18 </sup&gt;. Ainsi, TNNT2 n&#39;est pas nécessairement un marqueur spécifique de cardiomyogenesis humain in vitro. MLC2v et MLC2a sont couramment utilisés comme marqueurs de la ventriculaires et auriculaires sous-types, respectivement. Cependant, les défis de s&#39;appuyer sur MLC2v et MLC2a pour déterminer le sous-type cardiomyocytes dans le contexte de la différenciation in vitro proviennent du fait que ces produits de gènes peuvent pas se limiter à une chambre spécifique au cours du développement cardiaque, du tube de cœur par adulte. Dans la boucle rongeur coeur, MLC2a ARNm est prédominante dans la / zone des voies d&#39;entrée de l&#39;oreillette et MLC2v ARNm est prédominante dans les régions du tractus ventriculaire / évacuation. Au coeur en boucle, la co-expression de MLC2a et MLC2v ARNm sont observés dans le tractus d&#39;entrée, canal atrio-ventriculaire, et la voie d&#39;éjection 19,20. En trois jours après la naissance, MLC2v ARNm est limitée au ventricule et de 10 jours après la naissance, MLC2a est limité aux oreillettes du coeur de rat nouveau-né 19. Par conséquent, l&#39;interprétationde données concernant l&#39;efficacité cardiomyogenèse et l&#39;identité de sous-type ne doivent pas seulement tenir compte de la présence et la quantité de niveaux de marqueurs de référence, mais doivent tenir compte du stade de développement (s) à laquelle les points dans le temps de la différenciation qui sont analysés correspondent. Cela est particulièrement important étant donné que la phase de maturation des cellules cardiomyogéniques générées par la différenciation in vitro de hPSCs ressemble le plus à ceux du développement embryonnaire / 21-25. Ainsi, en s&#39;appuyant sur l&#39;expression spatiale d&#39;un marqueur au cœur postnatale peut ne pas être approprié pour l&#39;évaluation des cellules HPSC dérivés, au moins dans certains cas. Dans un effort pour faciliter l&#39;élaboration de critères plus spécifiques pour définir l&#39;identité des cardiomyocytes in vitro, TNNI3 est considérée comme un marqueur utile pour évaluer cardiomyogenèse in vitro comme il est limité au muscle cardiaque tout au long de l&#39;embryogenèse chez les poussins et le poisson zèbre 15,20et est absent dans le muscle squelettique foetal humain 26. Alors que TNNI1 est présent dans le cœur du fœtus humain, TNNI3 est la seule isoforme TNNI présente dans le cœur adulte normal 27,28. En ce qui concerne l&#39;identité du sous-type cardiomyocytes, Irx4 29-31 est un marqueur informatif des cellules avec un sort ventriculaire. Au niveau de la protéine, Irx4 a récemment été montré être limitée au ventricule du tube cardiaque linéaire à travers les étapes néonatale chez la souris 32. En conséquence, les protocoles de coloration optimisés pour l&#39;analyse de TNNI3 Irx4 et par cytométrie de flux sont décrits. À notre connaissance, ceci est la première description d&#39;une méthode efficace pour la coloration et l&#39;analyse des niveaux de Irx4 dans les cardiomyocytes humains à base d&#39;anticorps par cytométrie de flux.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

Il ya un besoin urgent de développer des approches pour réparer le cœur endommagé, la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques qui n&#39;ont pas d&#39;effets toxiques sur le cœur, et l&#39;amélioration des stratégies de modéliser avec précision les maladies cardiaques. Le potentiel de l&#39;exploitation induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSC) la technologie de l&#39;humain pour générer muscle cardiaque &quot;dans un plat&quot; pour ces applications continue de susciter un grand enthousiasme. Au cours des dernières années, la capacité de générer efficacement des cellules cardiomyogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) s&#39;est grandement améliorée, nous offrant de nouvelles possibilités pour modéliser un stade très précoce du développement cardiaque humaine pas accessibles autrement. Contrairement à de nombreux procédés antérieurs, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas l&#39;agrégation cellulaire ou l&#39;addition d&#39;activine A ou BMP4 et génère robuste des cultures de cellules qui sont hautement positives pour la troponine I cardiaque et T (TNNI3, TNNT2), iroquois- protéine à homéodomaine de classeIRX-4 (Irx4), la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme ventriculaire / du muscle cardiaque (MLC2v) et la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme auriculaire (MLC2a) par jour 10 dans l&#39;ensemble cellule souches embryonnaires humaines (CSEh) et les lignes hiPSC testé pour jour. Les cellules peuvent être passées et entretenus pendant plus de 90 jours de culture. La stratégie est techniquement simple à mettre en oeuvre et économique. Caractérisation des cardiomyocytes dérivés de cellules pluripotentes comprennent souvent l&#39;analyse de marqueurs de référence, à la fois au niveau de l&#39;ARNm et des protéines. Pour l&#39;analyse des protéines, la cytométrie de flux est un puissant outil d&#39;analyse pour l&#39;évaluation de la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogène. Cependant, la variation technique dans la préparation de l&#39;échantillon peut affecter considérablement la qualité de cytométrie de flux de données. Ainsi, la standardisation des protocoles de coloration devrait faciliter les comparaisons entre les différentes stratégies de différenciation. En conséquence, optimisé protocoles de coloration pour l&#39;analyse de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, et TNNT2 par cytométrie de flux sont décrits.

Au jour 0, les cellules sont confluentes à 100% avec la morphologie compacte et les débris de cellules minimal. Le jour 2.1, il est courant d&#39;observer la mort cellulaire significative (40-50%), mais les cellules attachées conservera morphologie compacte (figure 1A). Pendant ce temps, les médias est orange et trouble. Médias rose indique la mort cellulaire excessive, et dans ce cas, confirmer au bleu trypan et cesser si la mort de la cellule dépasse 70%. Les cellules seront guéris pendant les ...

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High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

L&#39;article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d&#39;une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l&#39;homogénéité et l&#39;identité de la population.

Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Recherche

Biologie

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Haut débit mesure de Dictyostelium discoideum macropinocytose par cytométrie en flux

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Caractérisation de la protéine transmembranaire d’une vésicule extracellulaire unique par cytométrie nano-flux

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...