Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
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इस शोध एनआईएच 4R00HL094708-03 द्वारा समर्थित किया गया था, MCW रिसर्च मामलों की समिति नई संकाय पुरस्कार, और विस्कॉन्सिन मेडिकल कॉलेज (RLG) में सर्द फाउंडेशन (स्टार्टअप धन); हांगकांग थीम आधारित अनुसंधान योजना T13-706 / 11 (KRB) के अनुसंधान अनुदान परिषद; U01 HL099776, सीआईआरएम TR3-05556, सीआईआरएम DR2A-05394, और अहा अन्वेषक पुरस्कार (JCW) की स्थापना की; अहा Postdoctoral फैलोशिप 12POST12050254 (PWB). हम डेटा संग्रह और पांडुलिपि की सावधानी से समीक्षा के साथ सहायता के लिए विस्कॉन्सिन के रक्त अनुसंधान संस्थान के फ्लो कोर में आशा कैम्पबेल धन्यवाद.

1 समाधान और मीडिया तैयारी <ol><li> hESC योग्य मैट्रिक्स कोटिंग स्टॉक समाधान <ol><li> धीरे धीरे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर hESC बर्फ पर योग्य मैट्रिक्स (5 एमएल) पिघलना. 1.5 मिलीलीटर बाँझ, पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूबों में aliquots ब?...

भेदभाव प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण भेदभाव की शुरुआत करने से पहले कम से कम पांच मार्ग के लिए एकल कोशिका स्तर पर passaged गया है कि hPSCs की उच्च गुणवत्ता संस्कृतियों का इस्तेमाल होता है. वे सेल लाइन की स?...

hESC और hiPSC सहित hPSCs, से cardiomyocytes की पीढ़ी यंत्रवत अध्ययनों के लिए अन्यथा सुलभ नहीं चरणों में अंतर्दृष्टि प्रदान, बहुत जल्दी मानव हृदय विकासात्मक प्रक्रियाओं के इन विट्रो मॉडल के रूप में कार्य कर सकते हैं. इस मॉडल प्रणाली हृदय वंश प्रतिबद्धता और सेल भाग्य विनिर्देश कि नियंत्रण आणविक मार्ग का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. हाल के वर्षों में, कुशलता hPSCs से cardiomyogenic कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता बहुत 1-15 सुधार हुआ है. हालांकि, प्रोटोकॉल के बीच कोशिकाओं कक्ष विशिष्ट मार्कर (जैसे, निलय और अटरिया) व्यक्त जिस पर cardiomyogenic कोशिकाओं और समय पैदा करने में दक्षता के संबंध में सेल लाइन भिन्नता है. आदर्श रूप में, इस मॉडल प्रणाली के भविष्य के लिए आवेदन पत्र, कार्यात्मक रूप में परिभाषित कोशिकाओं की अधिक सजातीय आबादी वांछित हैं. पिछले विधियों के विपरीत, cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल CE आवश्यकता नहीं है यहाँ वर्णितडालूँगा एकत्रीकरण या मजबूती Activin एक या हड्डी Morphogenetic प्रोटीन 4 (BMP4) और के अलावा दिन से TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, और MLC2a के लिए संस्कृतियों अत्यधिक सकारात्मक तारीख को सभी परीक्षण hESC और hiPSC लाइनों भर में 10 कोशिकाओं को उत्पन्न करता है. रणनीति विशेष रूप से तीन आयामी संस्कृतियों, जन संस्कृति, या embryoid शरीर आधारित रणनीतियों 4-9 की तुलना में लागू करने के लिए तकनीकी रूप से सरल है, और हाल ही में hPSCs को चयनात्मक विषाक्तता के साथ एक छोटा सा अणु का वर्णन है कि एक अध्ययन (Boheler एट अल में परिभाषित किया गया था. ) 65. इस प्रोटोकॉल की विशेषताएं, छोटे अणुओं का उपयोग पूरी तरह से परिभाषित मीडिया (अभी तक अलग 1,2,7,13 से इसी तरह,) Wnt संकेतन मिलाना एक hESC योग्य मैट्रिक्स (Matrigel) की एक परत का उपयोग monolayer संस्कृति में hPSCs का भेदभाव शामिल हैं, और भेदभाव दक्षता और सेल पहचान के मूल्यांकन के लिए धुंधला तरीकों cytometry अनुकूलित प्रवाह. पिछली रिपोर्टों इसकी लागत प्रभावी ढंग से शामिल करने के लिए संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के फायदे की तुलनाeness, reproducibility, और hESC और hiPSC लाइनों सहित कई hPSC लाइनों के बीच cardiomyocytes पैदा करने के लिए अपने उच्च दक्षता. प्रवाह cytometry संस्कृति में कोशिकाओं की गुणवत्ता का आकलन करने और subpopulation एकरूपता का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है, और उचित प्रायोगिक डिजाइन के साथ, मात्रात्मक माप प्रदान कर सकते हैं. सभी प्रतिरक्षी आधारित रणनीति के साथ के रूप में, प्रयोगात्मक परिणामों की सही व्याख्या उप इष्टतम स्थितियों में काफी एंटीबॉडी की क्षमता को प्रभावित के रूप में एंटीबॉडी एकाग्रता और निर्धारण और permeabilization शर्तों (intracellular एंटीजन को लक्ष्य बनाते समय) सहित परख डिजाइन के तत्वों के प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए जांच की जाती है कि आवश्यकता , परिणामों की व्याख्या बंधन, और इसलिए. Quantitation आवश्यक है, तो पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी कई epitopes पहचान और बैच करने वाली बैच भिन्नता होने का खतरा हो सकता है के रूप में महत्वपूर्ण बात है,, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, आवश्यक हैं. वर्तमान में, एंटीबॉडी के एक किस्म (पीओlyclonal और मोनोक्लोनल) और धुंधला प्रोटोकॉल यह मुश्किल प्रोटोकॉल 1,2,9,11 बीच cardiomyogenesis की दक्षता तुलना करने के लिए कर रही है, इन विट्रो भेदभाव के आकलन के लिए वर्णित किया गया है. सभी फ्लो विश्लेषण के लिए उपलब्ध है जब कि कारण के लिए, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है. आगे जा रहे हैं, यह बेहतर भेदभाव रणनीतियों के बीच तुलना की अनुमति चाहिए, विशेष रूप से quantitation का संबंध है, ये धुंधला प्रोटोकॉल की कि मानकीकरण की उम्मीद है. इन विट्रो cardiomyogenesis की शुद्धता का आकलन किया मार्कर का विकल्प है, और उनके इसी एंटीबॉडी, रिपोर्टों के बीच बदलता है. TNNT2 cardiomyogenic भाग्य के लिए प्रतिबद्ध कोशिकाओं का सूचक माना गया है और नियमित हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल की दक्षता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, TNNT2 भी जल्दी लड़की और चूहे विकास 16,17 दौरान कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त किया है और यह मानव चिकनी पेशी 18 में मौजूद है </sup&gt;. इस प्रकार, TNNT2 जरूरी विट्रो में मानव cardiomyogenesis की एक विशिष्ट मार्कर नहीं है. MLC2v और MLC2a नियमित क्रमशः, निलय और आलिंद उपप्रकार के किराए मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है. हालांकि, इन विट्रो भेदभाव के संदर्भ में cardiomyocyte उप प्रकार निर्धारित करने के लिए MLC2v और MLC2a पर निर्भर के साथ चुनौतियों इन जीन उत्पादों वयस्क के माध्यम से दिल ट्यूब से, हृदय के विकास में एक विशिष्ट कक्ष तक ही सीमित नहीं किया जा सकता है कि इस तथ्य से उत्पन्न होती हैं. कृंतक दिल looped में, MLC2a mRNA आलिंद / प्रवाह पथ के क्षेत्र में प्रमुख है और MLC2v mRNA निलय / बहिर्वाह पथ क्षेत्रों में प्रमुख है. Looped दिल में, MLC2a और MLC2v mRNAs के सह अभिव्यक्ति प्रवाह पथ, atrioventricular नहर, और बहिर्वाह पथ 19,20 में मनाया जाता है. जन्म के बाद 3 दिन तक, MLC2v mRNA निलय तक ही सीमित है और जन्म के बाद 10 दिन से, MLC2a नवजात चूहे दिल 19 में अटरिया के लिए प्रतिबंधित है. इसलिए, व्याख्याcardiomyogenesis दक्षता और उप पहचान केवल संदर्भ मार्कर के स्तर की उपस्थिति और मात्रा पर विचार नहीं करना चाहिए, लेकिन जो विश्लेषण कर रहे हैं कि भेदभाव की timepoints अनुरूप करने के लिए विकास मंच (ओं) पर विचार करना चाहिए के बारे में डेटा की. इस hPSCs की इन विट्रो भेदभाव से उत्पन्न cardiomyogenic कोशिकाओं की परिपक्वता चरण सबसे निकट भ्रूण / भ्रूण के विकास 21-25 के उन जैसा होता है पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, प्रसव के बाद दिल में एक मार्कर के स्थानिक अभिव्यक्ति पर भरोसा कम से कम कुछ मामलों में hPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं के आकलन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. इन विट्रो में cardiomyocyte पहचान को परिभाषित करने के लिए और अधिक विशिष्ट मानदंडों के विकास में मदद करने के प्रयास में, TNNI3 यह लड़की और zebrafish 15,20 में embryogenesis भर में हृदय की मांसपेशी तक ही सीमित है के रूप में इन विट्रो में cardiomyogenesis के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान मार्कर माना जाता हैऔर मानव भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी 26 में अनुपस्थित है. TNNI1 मानव भ्रूण दिल में मौजूद है, TNNI3 सामान्य वयस्क दिल 27,28 में केवल TNNI isoform मौजूद है. Cardiomyocyte उप प्रकार पहचान के बारे में, IRX4 29-31 वेंट्रिकुलर भाग्य के साथ कोशिकाओं की एक जानकारीपूर्ण मार्कर है. प्रोटीन के स्तर पर, IRX4 हाल ही में माउस 32 में नवजात चरणों के माध्यम से रेखीय दिल ट्यूब से निलय के लिए प्रतिबंधित किया जा दिखाया गया है. तदनुसार, फ्लो द्वारा TNNI3 का विश्लेषण और IRX4 लिए अनुकूलित धुंधला प्रोटोकॉल वर्णित हैं. हमारे ज्ञान करने के लिए, इस फ्लो द्वारा कुशल एंटीबॉडी आधारित धुंधला और मानव cardiomyocytes में IRX4 स्तर के विश्लेषण के लिए एक विधि की पहली वर्णन है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

क्षतिग्रस्त दिल की मरम्मत के दिल पर विषाक्त प्रभाव नहीं है कि नई चिकित्सकीय दवाओं की खोज, और सही ढंग से हृदय रोग मॉडल के लिए रणनीति में सुधार के लिए दृष्टिकोण विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है. इन अनुप्रयोगों के लिए &quot;एक थाली में&quot; हृदय की मांसपेशी उत्पन्न करने के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) प्रौद्योगिकी शोषण के संभावित उच्च उत्साह उत्पन्न करने के लिए जारी है. हाल के वर्षों में, कुशलता मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से cardiomyogenic कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता बहुत अन्यथा सुलभ नहीं मानव हृदय के विकास के बहुत प्रारंभिक दौर मॉडल करने के लिए हमें नए अवसरों की पेशकश, में सुधार हुआ है. पिछले कई तरीकों के विपरीत, cardiomyocyte भेदभाव प्रोटोकॉल सेल एकत्रीकरण या Activin एक या BMP4 के अलावा आवश्यकता नहीं है यहाँ वर्णित और मजबूती कार्डियक ट्रोपोनिन के लिए बेहद सकारात्मक हैं कि कोशिकाओं की संस्कृतियों उत्पन्न मैं और टी (TNNI3, TNNT2), iroquois- वर्ग homeodomain प्रोटीनIRX -4 (IRX4), मायोसिन- विनियामक प्रकाश श्रृंखला 2, निलय / हृदय की मांसपेशी isoform (MLC2v) और मायोसिन विनियामक प्रकाश श्रृंखला 2, सभी मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) और hiPSC लाइनों के पार सुबह 10 से आलिंद isoform (MLC2a) के लिए परीक्षण किया तिथि. कोशिकाओं passaged और संस्कृति में अधिक से अधिक 90 दिनों के लिए रखा जा सकता है. रणनीति तकनीकी रूप से लागू करने के लिए सरल और लागत प्रभावी है. Pluripotent कोशिकाओं से व्युत्पन्न cardiomyocytes की विशेषता अक्सर mRNA और प्रोटीन के स्तर पर दोनों संदर्भ मार्कर का विश्लेषण भी शामिल है. प्रोटीन विश्लेषण के लिए, प्रवाह cytometry संस्कृति में कोशिकाओं की गुणवत्ता का आकलन करने और subpopulation एकरूपता का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक उपकरण है. हालांकि, नमूना तैयार करने में तकनीकी भिन्नता काफी डाटा प्रवाह cytometry की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. इस प्रकार, धुंधला प्रोटोकॉल का मानकीकरण विभिन्न भेदभाव रणनीतियों के बीच तुलना की सुविधा चाहिए. तदनुसार, IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, और टाइम्स न्यूज नेटवर्क के विश्लेषण के लिए धुंधला प्रोटोकॉल अनुकूलितप्रवाह से टी 2 cytometry वर्णित हैं.

0 दिन में, कोशिकाओं कॉम्पैक्ट आकारिकी और न्यूनतम सेल मलबे के साथ 100% मिला हुआ हैं. दिन में 1-2, यह महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु (40-50%) निरीक्षण करने के लिए आम बात है, लेकिन संलग्न कोशिकाओं कॉम्पैक्ट आकारिकी (चित?...

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High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

लेख कुशलता से चुनिंदा संदर्भ मार्कर का विश्लेषण आबादी की एकरूपता और पहचान का आकलन करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा पीछा Wnt मार्ग, modulating द्वारा cardiomyocytes में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन है.

फ्लो द्वारा उच्च क्षमता cardiomyocytes को मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और विशेषता

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Stemgent मानव TF lentivirus के साथ मानव Fibroblasts Reprogramming प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी सेट

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के Oligodendrocyte व्यापारियों में भेदभाव

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

माउस meiotic कक्ष का फ्लो Cytometry शोधन

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल Transfecting और Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव कार्डिएक व्यापारियों और cardiomyocytes के कुशल व्युत्पत्ति

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव cardiomyocytes की पीढ़ी: फीडर से मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से एक भेदभाव प्रोटोकॉल

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

स्पेक्ट्रल प्रवाह cytometry द्वारा ठोस ऊतकों से पृथक सेल निलंबन का विश्लेषण

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

प्रवाह Cytometry द्वारा Dictyostelium discoideum Macropinocytosis का उच्च-प्रवाह मापन

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी-सेल में माइटोकॉन्ड्रियल मास और झिल्ली क्षमता का मापन

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

नैनो-फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल बाह्य पुटिका ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन लक्षण वर्णन

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...