Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av NIH 4R00HL094708-03, MCW Forskning Affairs Committee New Fakultet Award, og Kern foundation (oppstart midler) ved Medical College of Wisconsin (RLG); Forskningsmidler Council of Hong Kong Tematisk Forsknings Scheme T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, og AHA Etablert Investigator Award (JCW); AHA postdoktorstipend 12POST12050254 (PWB). Vi takker Håp Campbell ved flowcytometri Kjerne av Blood Research Institute of Wisconsin for å få hjelp med datainnsamling og nøye gjennomgang av manuskriptet.

1. Løsning og Media Forberedelse <ol><li> hESC Kvalifisert Matrix Coating Stock Solution <ol><li> Sakte tine hESC kvalifisert matrise (5 ml) på isen ved 4 ° C over natten. Dispensere alikvotene i på forhånd nedkjølte, 1,5 ml steril mikrosentrifugerør og umiddelbart oppbevar ved -20 ° C. MERK: Volumet av delmengde vil variere basert på mye og vanligvis varierer 270-350 mL. Produsentens gir detaljer angående volumet av alikvoten er nødvendig for å oppnå en konsentrasjon på 1 x fortynning i 25 ml som...

Kritisk for å lykkes med differensiering protokollen er bruken av høykvalitets kulturer av hPSCs som er passaged på celle-nivået i minst fem passeringer før starten av differensieringen. Lignende differensiering effektivitet blir rutinemessig observert blant ulike hPSC linjer hvis de er 100% konfluent ved starten av differensiering, uavhengig av cellelinje. Suboptimal effektivitet er observert hvis samløpet av celler i starten av differensiering er ≤95% eller&gt; 100%. Derfor bør seeding tetthet og timing av ag...

Generering av cardiomyocytes fra hPSCs, inkludert hESC og hiPSC, kan fungere som en in vitro modell av svært tidlige humane kardiale utviklingsprosesser, og gir innsikt i etapper ellers ikke er tilgjengelig for mekanistiske studier. Denne modellen system gir unike muligheter til å studere molekylære mekanismer som styrer hjerte avstamning engasjement og celle skjebne spesifikasjon. I de senere årene har evnen til å effektivt generere cardiomyogenic celler fra hPSCs kraftig forbedret 1-15. Men blant protokoller er det cellelinje variasjon med hensyn til effektivitet i å generere cardiomyogenic celler og tidspunktet når cellene uttrykker kammer-spesifikke markører (f.eks ventrikkel og atrier). Ideelt for fremtidige anvendelser av denne modellsystem, er mer homogene populasjoner av funksjonelt definerte celler ønsket. I motsetning til tidligere fremgangsmåter, den cardiomyocyte differensiering protokoll beskrevet her krever ikke cell aggregering eller tillegg av activin A eller Benmorfogenetiske protein 4 (BMP4) og robust genererer kulturer svært positivt for TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, og MLC2a etter dag 10 celler på tvers av alle hESC og hiPSC linjer testet til dags dato. Strategien er teknisk enkelt å implementere, spesielt i forhold til tredimensjonale kulturer, massekultur, eller embryoid kroppen baserte strategier 4-9, og ble nylig definert i en studie som beskriver et lite molekyl med selektiv toksisitet til hPSCs (Boheler et al. ) 65. Funksjoner i denne protokollen omfatter differensiering av hPSCs i monolayer kultur ved hjelp av et enkelt lag av en hESC kvalifisert matrise (Matrigel), fullt definerte medier ved hjelp av små molekyler for å modulere Wnt signal (lignende, men likevel forskjellig fra 1,2,7,13), og optimalisert flowcytometri flekker metoder for evaluering av differensiering effektivitet og celle identitet. Oppsummert fordelene ved denne protokollen i forhold til tidligere rapporter inkluderer sin kostnads ​​effectiveness, reproduserbarhet, og høy effektivitet for å generere cardiomyocytes mellom flere hPSC linjer, inkludert hESC og hiPSC linjer. Strømningscytometri er en kraftig analytisk verktøy for å bedømme kvaliteten av celler i kulturen, og å bestemme subpopulasjon homogenitet, og med riktig eksperimentell design, kan gi kvantitative målinger. Som med alle antistoffbaserte strategier, nøyaktig tolkning av eksperimentelle resultater krever at elementene i analysen utforming inkludert antistoff konsentrasjon og fiksering og permeabilization forhold (når målretting intracellulære antigener) er nøye testet for hvert antistoff som sub-optimale forhold i vesentlig grad påvirker effektiviteten av antistoff binding, og derfor, tolkning av resultatene. Viktigere, hvis kvantitering er nødvendig, monoklonale antistoffer er viktig, som polyklonale antistoffer kan gjenkjenne multiple epitoper og er utsatt for batch-til-batch-variant. For tiden er en rekke antistoffer (polyclonal og monoklonale) og flekker protokoller har blitt beskrevet for vurdering av in vitro differensiering, noe som gjør det vanskelig å sammenligne effektiviteten av cardiomyogenesis blant protokoller 1,2,9,11. Derfor er monoklonale antistoffer som brukes når det er tilgjengelig for alle flowcytometri analyser. Fremover ventes det at standardisering av disse farge protokoller, spesielt med hensyn til kvantifisering, bør bedre tillate sammenligning mellom differensieringsstrategier. Valget av markører, og deres tilsvarende antistoffer, som brukes for å vurdere renhet på in vitro cardiomyogenesis varierer mellom rapporter. TNNT2 har vært ansett som en indikator på celler forpliktet til cardiomyogenic skjebne og blir rutinemessig brukt til å vurdere effektiviteten av hjerte differensiering protokoller. Imidlertid er TNNT2 også uttrykt i skjelettmuskel under tidlig kylling og rotte utvikling 16,17, og det er til stede i human glatt muskulatur 18 </sup&gt;. Således er TNNT2 ikke nødvendigvis en spesifikk markør av humant cardiomyogenesis in vitro. MLC2v og MLC2a blir rutinemessig brukt som surrogatmarkører for ventrikulære og atrial subtyper, henholdsvis. Imidlertid utfordringer med å stole på MLC2v og MLC2a å bestemme cardiomyocyte subtype i forbindelse med in vitro differensiering oppstår fra det faktum at disse genproduktene ikke kan være begrenset til et bestemt kammer gjennom hjerte utvikling av hjerte rør gjennom voksen. I gnager loopet hjertet, er MLC2a mRNA dominerende i atrial / tilsig kanalen området og MLC2v mRNA er dominerende i ventrikkel / utbetaling veis regioner. I den løkke hjertet, er co-uttrykk for MLC2a og MLC2v mRNA observert i tilsig kanalen, atrioventrikulær kanal, og utløpskanalen 19,20. Av tre dager etter fødselen, er MLC2v mRNA begrenset til ventrikkelen og med 10 dager etter fødselen, er MLC2a begrenset til atriene i nyfødtrottehjerte 19. Derfor tolkningav data om cardiomyogenesis effektivitet og subtype identitet må ikke bare vurdere tilstedeværelse og mengde referanse markør nivåer, men må vurdere utviklingsstadiet (e) som de tidspunkter for differensiering som analyseres korrespondere. Dette er spesielt viktig med tanke på at modning stadium av cardiomyogenic celler generert av in vitro differensiering av hPSCs ligner mest på de av embryo / fosterutvikling 21-25. Dermed avhengig av en markør romlige uttrykk i barsel hjerte kan ikke være hensiktsmessig for vurderingen av hPSC-avledet celler, i hvert fall i noen tilfeller. I et forsøk på å legge til rette for utvikling av mer spesifikke kriterier for å definere cardiomyocyte identitet in vitro, er TNNI3 anses å være en verdifull markør for å vurdere cardiomyogenesis in vitro som det er begrenset til hjertemuskulatur hele embryogenesen i chick og sebrafisk 15,20og er fraværende i menneskelig fosterskjelettmuskulatur 26. Mens TNNI1 er tilstede i menneskelig fosterets hjerte, er TNNI3 den eneste TNNI isoform stede i normal voksen hjerte 27,28. Angå cardiomyocyte subtype identitet, IRX4 29-31 er en informativ markør av celler med en ventrikulær skjebne. På proteinnivå har IRX4 nylig blitt vist å være begrenset til ventrikkelen fra lineær hjerte rør gjennom neonatale stadier hos mus 32. Følgelig er optimalisert fargings protokoller for analyse av TNNI3 og IRX4 ved flowcytometri beskrevet. Så vidt vi vet, er dette den første beskrivelse av en fremgangsmåte for effektiv antistoff-baserte flekker og analyse av IRX4 nivåer i humane kardiomyocytter ved strømningscytometri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

Det er et presserende behov for å utvikle metoder for å reparere det ødelagte hjerte, oppdage nye terapeutiske legemidler som ikke har toksiske effekter på hjertet, og bedre strategier for å nøyaktig modelhjertesykdom. Potensialet i å utnytte menneskeskapte pluripotent stamcelle (hiPSC) teknologi for å generere hjertemuskulatur &quot;i en skål&quot; for disse programmene fortsetter å generere høy entusiasme. I de senere årene har evnen til å effektivt generere cardiomyogenic celler fra menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) kraftig forbedret, og tilbyr oss nye muligheter til å modellere svært tidlige stadier av menneskelig hjerte utvikling ellers ikke er tilgjengelig. I motsetning til mange tidligere metoder, cardiomyocyte differensiering protokollen beskrevet her ikke krever celle aggregering eller tillegg av activin A eller BMP4 og robust genererer kulturer av celler som er svært positivt for hjerte troponin I og T (TNNI3, TNNT2), iroquois- klasse homeodomain proteinIRX-4 (IRX4), myosin regulatoriske lett kjede 2, ventrikkel / hjertemuskulatur isoform (MLC2v) og myosin regulatoriske lett kjede 2, atrial isoform (MLC2a) etter dag 10 på tvers av alle humane embryonale stamceller (hESC) og hiPSC linjer testet til dato. Celler kan passaged og vedlikeholdes i mer enn 90 dager i kultur. Strategien er teknisk enkel å implementere og kostnadseffektiv. Karakterisering av kardiomyocytter avledet fra pluripotente celler ofte inneholder analyse av referansemarkører, både på mRNA og proteinnivå. For proteinanalyse, strømningscytometri er et kraftig analytisk verktøy for å bedømme kvaliteten av celler i kulturen, og å bestemme subpopulasjon homogenitet. Imidlertid kan teknisk variasjon i prøvepreparering i betydelig grad påvirke kvaliteten av flowcytometri data. Derfor bør standardisering av flekker protokoller lette sammenligninger mellom ulike differensieringsstrategier. Følgelig optimalisert fargingsprotokoller for analyse av IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, og TNNT2 ved strømningscytometri, er beskrevet.

På dag 0, celler er 100% konfluent med kompakt morfologi og minimal celleavfall. På dagene 1-2, er det vanlig å observere betydelig celledød (40-50%), men festede celler vil beholde kompakt morfologi (figur 1A). I løpet av denne tiden, er media oransje og grumset. Pink media indikerer dreven celledød, og i dette tilfellet, bekreft med trypanblått og slutte hvis celledød overstiger 70%. Celler blir igjen i løpet av 3-4 dager og tetthet vil øke. I løpet av dagene 5-6, oppstår minimal celledød...

Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Artikkelen beskriver den detaljerte metode for å effektivt skille humane pluripotente stamceller til kardiomyocytter ved selektivt å modulere Wnt veien, etterfulgt av strømningscytometri-analyse av referansemarkører for å vurdere homogenitet og identiteten av befolkningen.

High Efficiency Differensiering of Human Pluripotent stamceller til Cardiomyocytes og karakterisering med flowcytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse av cellesuspensjoner Isolert fra solid vev ved Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Høy gjennomstrømming-måling av Dictyostelium discoideum Macropinocytosis av Flow cytometri

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Måling av mitokondrie masse og membran potensial i blodkreft stamceller og T-celler ved Flow flowcytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Enkelt ekstracellulær vesikkel transmembranproteinkarakterisering ved nano-flowcytometri

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...