Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiado pelo NIH 4R00HL094708-03, Assuntos MCW Pesquisa Comitê Nova Faculdade Award, ea fundação Kern (fundos de inicialização) no Medical College of Wisconsin (RLG); Conselho bolsas de investigação de base-Tema Hong Kong Esquema Research T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM Dr2a-05394, e AHA Fundada Investigator Award (JCW); AHA pós-doutorado 12POST12050254 (PWB). Agradecemos a esperança Campbell no Citometria de Fluxo Núcleo do Instituto de Wisconsin Research sangue para obter assistência com a coleta de dados e análise criteriosa do manuscrito.

1. Solution e preparação da mídia <ol><li> hESC Matrix Qualificado revestimento da Solução <ol><li> Lentamente descongelar hESC matriz qualificado (5 ml) em gelo, a 4 ° C durante a noite. Dispense alíquotas em microtubos pré-refrigerados, 1,5 ml estéril e armazenar imediatamente a -20 ° C. NOTA: O volume da alíquota vai variar com base no lote e varia tipicamente 270-350 ul. Fabricante fornece detalhes sobre o volume de alíquota necessária para alcançar uma concentração 1x por diluição em 25 m...

Crítico para o sucesso do protocolo de diferenciação é a utilização de culturas de elevada qualidade de hPSCs que foram passadas a nível da célula individual durante pelo menos cinco passagens antes do início da diferenciação. Diferenciação eficiências semelhantes são habitualmente observado entre as várias linhas de HPSC se forem 100% confluentes no início da diferenciação, independente da linha de células. Eficácia subóptima é observado se a confluência de células no início de diferenciação...

A geração de cardiomiócitos de hPSCs, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC, pode funcionar como um modelo in vitro de processos de desenvolvimento cardíacos humanos muito antigos, fornecendo informações sobre as fases de outra forma não acessíveis para estudos mecanicistas. Este modelo de sistema fornece uma oportunidade única para estudar as vias moleculares que controlam o compromisso linhagem cardíaca e especificação destino celular. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica de hPSCs tem melhorado muito 1-15. No entanto, entre os protocolos há uma variação de linha de células no que respeita à eficiência na geração de células cardiomiogênica e tempo em que as células expressam marcadores específicos de câmara (por exemplo, átrios e ventrículo). Idealmente, para aplicações futuras deste sistema modelo, as populações mais homogêneas de células funcionalmente definidos são desejados. Em contraste com os métodos anteriores, a diferenciação de cardiomiócitos protocolo aqui descrito não necessita cell agregação ou a adição de Activin A ou proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) e robusta gera culturas altamente positivo para TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v e MLC2a por dia 10 células em todas as linhas hESC e hiPSC testadas até o momento. A estratégia é tecnicamente simples de implementar, especialmente em comparação com culturas tridimensionais, cultura de massa, ou estratégias baseadas corpo embrióide 4-9, e recentemente foi definido em um estudo que descreve uma pequena molécula com toxicidade seletiva para hPSCs (Boheler et al. ) 65. Características deste protocolo incluem a diferenciação hPSCs em cultura em monocamada, utilizando uma única camada de uma matriz qualificado hESC (Matrigel), meios totalmente definidos, utilizando pequenas moléculas para modular a sinalização Wnt (similar, mas distinto do 1,2,7,13), e fluxo optimizado citometria de métodos de coloração para avaliação da eficiência da diferenciação e da identidade da célula. Em resumo, as vantagens deste protocolo em relação a relatórios anteriores incluem o seu custo-effectiveness, reprodutibilidade e sua alta eficiência para a geração de cardiomiócitos entre várias linhas HPSC, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC linhas. A citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células em cultura e determinação subpopulação homogeneidade e com design experimental adequada, pode fornecer medições quantitativas. Tal como acontece com todas as estratégias baseadas em anticorpos, a interpretação precisa dos resultados experimentais exige que os elementos do desenho do ensaio, incluindo concentração de anticorpos e fixação e condições de permeabilização (quando segmentação antígenos intracelulares) são cuidadosamente testados para cada anticorpo como condições sub-ótimas afetar significativamente a eficiência de anticorpo ligação, e portanto, a interpretação dos resultados. É importante notar que se a quantificação é necessária, os anticorpos monoclonais são essenciais, tal como anticorpos policlonais podem reconhecer epitopos múltiplos e são propensos a variação de lote para lote. Actualmente, uma variedade de anticorpos (poprotocolos lyclonal e monoclonais) e de coloração têm sido descritos para a avaliação da diferenciação in vitro, o que torna difícil comparar a eficiência de cardiomyogenesis entre protocolos 1,2,9,11. Por essa razão, os anticorpos monoclonais são utilizados quando disponíveis para todas as análises de citometria de fluxo. Para o futuro, espera-se que a padronização destes protocolos de coloração, especialmente com relação à quantificação, deve permitir uma melhor comparação entre estratégias de diferenciação. A escolha dos marcadores, e os seus anticorpos correspondentes, utilizados para avaliar a pureza de cardiomyogenesis in vitro varia entre os relatórios. TNNT2 tem sido considerado um indicador das células comprometidas com o destino cardiomiogênica e é rotineiramente utilizado para avaliar a eficiência de protocolos de diferenciação cardíacos. No entanto, também é TNNT2 expresso no músculo esquelético durante o início de pinto de rato e o desenvolvimento 16,17 e está presente no músculo liso humano 18 </sup&gt;. Assim, TNNT2 não é, necessariamente, um marcador específico de cardiomyogenesis humana in vitro. MLC2v e MLC2a são rotineiramente utilizados como marcadores substitutos de subtipos ventriculares e atriais, respectivamente. No entanto, os desafios com contando com MLC2v e MLC2a para determinar o subtipo de cardiomiócitos no contexto de diferenciação in vitro surgem do fato de que estes produtos de genes não pode ser restrito a uma câmara específica ao longo do desenvolvimento cardíaco, tubo de coração através de um adulto. No roedor loop coração, MLC2a mRNA é predominante na zona do átrio / entrada trato e MLC2v mRNA é predominante nas regiões do trato ventricular / descarga. No coração loop, co-expressão de MLC2a e MLC2v mRNAs são observados na via de entrada, canal atrioventricular, e via de saída 19,20. Aos 3 dias após o nascimento, MLC2v mRNA é restrito para o ventrículo e, aos 10 dias após o nascimento, MLC2a é restrita às aurículas do coração de rato neonatal 19. Portanto, a interpretaçãode dados sobre a eficiência cardiomyogenesis e subtipo identidade não só deve considerar a presença ea quantidade de níveis de marcadores de referência, mas deve considerar o estágio (s) de desenvolvimento a que os instantes de diferenciação que são analisados ​​correspondem. Isto é especialmente importante considerando-se que a fase de maturação das células cardiomiogênica gerados pela diferenciação in vitro de hPSCs mais se assemelha aqueles do desenvolvimento embrionário / fetal 21-25. Assim, com base na expressão espacial de um marcador no coração pós-natal pode não ser apropriado para a avaliação de células HPSC derivados, pelo menos em alguns casos. Em um esforço para facilitar o desenvolvimento de critérios mais específicos para a definição da identidade de cardiomiócitos in vitro, TNNI3 é considerada um marcador importante na avaliação de cardiomyogenesis in vitro, uma vez que é restrito no músculo cardíaco durante toda a embriogênese em garota e peixe-zebra 15,20e está ausente no músculo esquelético humano fetal 26. Enquanto TNNI1 está presente no coração fetal humano, TNNI3 é a única isoforma presente TNNI no coração adulto normal 27,28. Quanto cardiomiócitos subtipo identidade, IRX4 29-31 é um marcador informativo de células com um destino ventricular. Ao nível da proteína, IRX4 foi recentemente mostrado para ser restringida ao ventrículo do coração do tubo linear através de estágios neonatais do rato 32. Por conseguinte, os protocolos de coloração optimizados para a análise de TNNI3 IRX4 e por citometria de fluxo encontram-se descritos. Para nosso conhecimento, esta é a primeira descrição de um método para a coloração com anticorpos e análise eficiente dos níveis IRX4 em cardiomiócitos humanos, por citometria de fluxo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

Há uma necessidade urgente de desenvolver abordagens para reparar o coração danificado, descobrir novas drogas terapêuticas que não têm efeitos tóxicos no coração, e melhorar as estratégias de modelar com precisão a doença cardíaca. O potencial de exploração da tecnologia humana célula-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) para gerar músculo cardíaco &quot;em um prato&quot; para estas aplicações continua a gerar grande entusiasmo. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem melhorado muito, nos oferecendo novas oportunidades para modelar estágios muito iniciais de desenvolvimento cardíaco humano não acessíveis de outra forma. Em contraste com muitos métodos anteriores, o protocolo de diferenciação de cardiomiócitos aqui descrito não requer a agregação de células, ou a adição de Activina A ou BMP4 e robustamente gera culturas de células que são altamente positivo para a troponina I cardíaca e T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína classe homeodomínioIRX-4 (IRX4), miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma muscular ventricular / cardíaco (MLC2v) e miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma atrial (MLC2a) por 10 dias em todas células estaminais embrionárias humanas (hESC) e linhas hiPSC testado para data. As células podem ser passadas e mantida por mais de 90 dias em cultura. A estratégia é tecnicamente simples de implementar e de baixo custo. Caracterização de cardiomiócitos derivados de células pluripotentes inclui muitas vezes a análise de marcadores de referência, tanto ao nível do mRNA e de proteínas. Para a análise de proteínas, a citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células na cultura e a determinação subpopulação homogeneidade. No entanto, a variação técnica na preparação da amostra pode afetar significativamente a qualidade de citometria de fluxo de dados. Assim, a padronização de protocolos de coloração deve facilitar as comparações entre as várias estratégias de diferenciação. Deste modo, optimizado para protocolos de coloração para a análise de IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 por citometria de fluxo encontram-se descritos.

No dia 0, as células são 100% confluentes com morfologia compacta e os detritos celulares mínima. Nos dias 1-2, é comum observar-se morte celular significativa (40-50%), mas as células anexadas reterá morfologia compacto (Figura 1A). Durante este tempo, a mídia é laranja e turva. Meios-de-rosa indica morte excessiva de células, e, neste caso, confirmar com azul de tripan e interromper se a morte celular superior a 70%. As células irão recuperar durante 3-4 dias e vai aumentar a densidade. Dur...

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High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Biologia

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Medição do elevado-throughput de Dictyostelium discoideum macropinocitose por citometria de fluxo

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Caracterização da Proteína Transmembrana da Vesícula Extracelular Única por Citometria de Nanofluxo

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...