Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

Это исследование было поддержано NIH 4R00HL094708-03, MCW ГУ МВД Комитет новый факультет премии, и основой Керн (запуска средства) в Медицинском колледже штата Висконсин (RLG); Научно-исследовательский совет по грантам Гонконг Тематический Исследование схемы T13-706 / 11 (КРФ); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, и AHA Основанная Следователь премии (JCW); AHA докторантуру 12POST12050254 (ПРБ). Мы благодарим Надежда Кэмпбелл в проточной цитометрии Ядра Крови исследовательского института Висконсина за помощь в сборе данных и тщательного анализа рукописи.

1 Решение и СМИ Подготовка <ol><li> чЭСК Квалифицированный Матрица Покрытие со Решение <ol><li> Медленно таять HESC квалифицированную матрицу (5 мл) на льду при 4 ° С в течение ночи. Разлить аликвоты в предварительно охлажденные, 1,5 мл стерильной микропробирок и сразу хранить при температуре -20 ° ?...

Критическое значение для успеха протокола дифференцировки является использование высококачественных культур hPSCs, которые были пассированных на уровне одной клетки, по крайней мере пять проходов до начала дифференциации. Которые обычно наблюдаются подобные эффективность дифференци...

Генерирование кардиомиоцитов из hPSCs, в том числе и чЭСК hiPSC, может функционировать в качестве модели в пробирке из самых ранних человеческих сердечных процессы развития, обеспечивая представление этапов не иначе, доступных для механистических исследований. Эта модель системы предоставляет уникальные возможности для изучения молекулярных путей, которые контролируют приверженность сердечной Lineage и клеточных судеб спецификацию. В последние годы, способность эффективно генерировать cardiomyogenic клетки от hPSCs значительно улучшилась 1-15. Тем не менее, среди протоколов есть изменение клеточной линии по отношению к эффективности генерации cardiomyogenic клеток и времени, при котором клетки экспрессируют камеры-специфических маркеров (например, желудочка и предсердий). В идеале, для будущих применений этой модельной системе, более однородные популяции клеток функционально заданных желательны. В отличие от предыдущих способов, протокол дифференциации кардиомиоцитов, описанный здесь, не требует CELL агрегации или добавление активин или костного морфогенетического белка 4 (BMP4) и энергично формирует культуры высоко положительным для TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v и MLC2a днем ​​10 клеток во всех чЭСК и hiPSC линий протестированных на сегодняшний день. Стратегия технически прост в реализации, особенно по сравнению с трехмерных культур, массовой культуры, или эмбриоид тела на основе стратегий 4-9, а в последнее время был определен в исследовании, которое описывает малую молекулу с селективной токсичностью к hPSCs (Boheler соавт. ) 65. Особенности этого протокола включают дифференциацию hPSCs в монослоя культуры с использованием одного слоя из ЭСК квалифицированным матрицы (Matrigel), полностью определенные СМИ, использующие небольшие молекулы для модулирования Wnt сигнализации (похоже, еще отличие от 1,2,7,13), и оптимизирована проточной цитометрии методов окрашивания для оценки эффективности дифференцировки и идентичности клеток. Таким образом, преимущества этого протокола по сравнению с предыдущим отчеты включают его экономическую effectiveness, воспроизводимость и его высокая эффективность генерации кардиомиоцитов между несколькими линиями HPSC, в том числе чЭСК и hiPSC линий. Проточной цитометрии является мощным аналитическим инструментом для оценки качества клеток в культуре и определения субпопуляционного однородность, и при правильном эксперимента, может обеспечить количественные измерения. Как и во всех стратегий на основе антител, точной интерпретации результатов эксперимента требует, чтобы элементы конструкции анализа концентрации антител в том числе и фиксации и условий проницаемости (при ориентации внутриклеточные антигены) тщательно проверены для каждого антитела, как суб-оптимальных условий существенно повлиять на эффективность антитела связывания, и поэтому, интерпретацию результатов. Важно отметить, что, если требуется количественное, моноклональные антитела имеют важное значение, так как поликлональные антитела могут распознавать множественные эпитопы и склонны к партии к партии вариации. В настоящее время множество антител (POlyclonal и моноклональные) и окрашивания протоколы были описаны для оценки дифференциации в пробирке, что делает его трудно сравнивать эффективность кардиомиогенеза среди протоколов 1,2,9,11. По этой причине, моноклональные антитела, которые используются, когда доступны для всех проточной цитометрии анализа. Забегая вперед, ожидается, что стандартизация этих протоколов окрашивания, особенно в отношении количественного, должны лучше разрешить сравнение между стратегиями дифференциации. Выбор маркеров, и их соответствующие антитела, используется для оценки чистоты в пробирке кардиомиогенеза варьирует среди отчетов. TNNT2 был считать показателем клеток, совершенных в cardiomyogenic судьбы и обычно используется для оценки эффективности протоколов сердечных дифференцировки. Тем не менее, TNNT2 также экспрессируется в скелетной мышце в начале кур и крыс развития 16,17 и он присутствует в человеческой гладких мышц 18 </sup&gt;. Таким образом, TNNT2 не обязательно является специфическим маркером человеческого кардиомиогенеза в пробирке. MLC2v и MLC2a обычно используются в качестве суррогатных маркеров желудочковых и предсердных подтипов, соответственно. Тем не менее, проблемы с опираясь на MLC2v и MLC2a определить кардиомиоцитов подтип в контексте дифференциации в пробирке связаны с тем, что эти генные продукты не могут быть ограничены на определенный камере на протяжении развития сердца, от сердечной трубки через взрослого. В грызун петлей сердце, MLC2a мРНК является преобладающим в области путей мерцательной / притока и MLC2v мРНК преобладает в регионах желудочка / выносящего тракта. В зацикленной сердце, ко-экспрессия MLC2a и MLC2v мРНК наблюдаются в приток тракта, атриовентрикулярного канала и тракта оттока 19,20. По 3 дней после рождения, MLC2v мРНК ограничивается желудочка и 10 дней после родов, MLC2a ограничивается предсердий в сердца новорожденной крысы 19. Поэтому интерпретацияиз данных о эффективности кардиомиогенеза и подтип идентичность должна учитывать не только наличие и количество уровней опорного маркера, но необходимо учитывать стадию (ы) с развитием в которых временные точки дифференциации, которые анализируются соответствовать. Это особенно важно, учитывая, что стадия созревания cardiomyogenic клеток, полученных путем экстракорпорального дифференциации в части hPSCs больше всего напоминает те из эмбриональной / фетальной развития 21-25. Таким образом, опираясь на пространственной экспрессии маркера в послеродовом сердце может не подходить для оценки HPSC-клеток, полученных, по крайней мере, в некоторых случаях. В стремлении содействовать развитию более конкретных критериев для определения кардиомиоцитов идентичность в пробирке, TNNI3 считается ценным маркером для оценки кардиомиогенеза в пробирке, как она ограничена сердечной мышцы в течение эмбриогенеза у кур и рыбок данио 15,20и отсутствует в человеческой эмбриональной скелетных мышц 26. В то время как TNNI1 присутствует в сердце плода человека, TNNI3 является единственным TNNI изоформы присутствует в нормальной взрослой сердце 27,28. Что касается кардиомиоцитов подтипа идентичности, IRX4 29-31 является информативным маркером клеток с судьбой желудочка. На белковом уровне, IRX4 недавно было показано, чтобы быть ограничен желудочка с линейной сердечной трубки через неонатальных стадии у мышей 32. Соответственно, оптимизированные протоколы окрашивания для анализа TNNI3 и IRX4 цитометрическим описаны. Насколько нам известно, это первое описание способа для эффективного окрашивания на основе антител и анализа уровней IRX4 в человеческих кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

Существует настоятельная необходимость в разработке подходов к ремонту поврежденного сердца, открывая новые терапевтические препараты, которые не имеют токсическое воздействие на сердце, и совершенствования стратегий для точного моделирования болезни сердца. Потенциал использования индуцированного технологию человека плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) для генерации сердечную мышцу &quot;в блюдо&quot; для этих приложений продолжает генерировать высокий энтузиазм. В последние годы, способность эффективно генерировать cardiomyogenic клетки от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) значительно улучшилась, предлагая нам новые возможности для моделирования очень ранние стадии развития сердца человеческого не иначе доступны. В отличие от многих предыдущих методов, протокол дифференциация кардиомиоцитов описано здесь не требует агрегации клеток или добавление активин А или BMP4 и энергично формирует культуру клеток, которые очень положительно для сердечного тропонина I и Т (TNNI3, TNNT2), iroquois- класс гомеодоменовый белокIRX-4 (IRX4), регуляторной легкой цепи миозина 2, желудочка / сердечной мышцы изоформы (MLC2v) и регуляторной легкой цепи миозина 2, мерцательной изоформы (MLC2a) на 10 день по всей человеческой эмбриональной стволовой клетки (чЭСК) и hiPSC линий испытания, чтобы Дата. Клетки могут быть пассировать и выдерживают в течение более чем 90 дней в культуре. Стратегия технически прост в реализации и экономически эффективным. Характеристика кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных клеток часто включает в себя анализ опорных маркеров, как на уровне мРНК и белка. Для анализа белков, проточной цитометрии является мощным аналитическим инструментом для оценки качества клеток в культуре и определения субпопуляционного однородности. Тем не менее, техническая изменение пробоподготовки может значительно повлиять на качество проточной цитометрии данных. Таким образом, стандартизация протоколов окрашивания должны облегчить сравнение между различными стратегиями дифференциации. Соответственно, оптимизированы протоколы окрашивания для анализа IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 и TNNТ2 с помощью проточной цитометрии описаны.

В день 0, клетки 100% сливной с компактной морфологии и минимальной клеточного дебриса. В дни 1-2, обычно наблюдать значительное гибель клеток (40-50%), но, прикрепленные клетки сохраняют компактную морфологию (фиг.1А). В течение этого времени, средств массовой информации становится ор...

Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

В статье описывается подробная методика эффективно дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, выборочно модуляции путь Wnt, а затем с помощью проточной цитометрии анализ опорных маркеров для оценки однородности и идентичности населения.

Высокая эффективность Дифференциация человека плюрипотентные стволовые клетки, чтобы кардиомиоцитов и характеристика цитометрическим

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования человеческих фибробластов с Stemgent правам лентивирус TF Установить

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Трансфекции и Nucleofecting человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Высок объём измерение сапротрофные discoideum макропиноцитозом, поток цитометрии

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала в гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках по цитометрии потока

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Характеристика одноклеточного везикулярного трансмембранного белка с помощью нанопоточной цитометрии

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...