Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

Denna forskning stöds av NIH 4R00HL094708-03, MCW Research frågor New Faculty Award, och Kern stiftelsen (start medel) vid Medical College of Wisconsin (RLG); Research Grants råd Hong Kong Theme baserad forskning Scheme T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05.394, och AHA Etablerad Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PWB). Vi tackar Hope Campbell vid Flödescytometri Kärna av blod Forskningsinstitut Wisconsin för hjälp med datainsamling och noggrann översyn av manuskriptet.

1 Lösning och Media Förberedelse <ol><li> hESC Kvalificerade Matrisbeläggningsförrådslösning <ol><li> Långsamt tina hESC kvalificerad matris (5 ml) på is vid 4 ° C över natten. Fördela portioner i förväg kylda, 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör och omedelbart i -20 ° C. OBS! Volymen av det delprov varierar beroende på mycket och vanligtvis sträcker sig från 270 till 350 | il. Tillverkare tillhandahåller uppgifter om volymen av delprov som krävs för att uppnå en 1x koncentration vid spädnin...

Kritiskt för framgången med differentieringsprotokoll är användningen av högkvalitativa kulturer av hPSCs som har passe vid enkelcellnivån i minst fem passager före starten av differentiering. Liknande differentiering effektivitet rutinmässigt observerats bland olika HPSC rader om de är 100% sammanflytande i början av differentiering, oberoende av cellinje. Suboptimal effektivitet observeras om sammanflödet av celler vid starten av differentiering är ≤95% eller&gt; 100%. Därför bör såddtäthet och tidp...

Genereringen av cardiomyocytes från hPSCs, inklusive stamceller från mänskliga embryon och hiPSC, kan fungera som en modell för mycket tidiga humana hjärt utvecklingsprocesser in vitro, som ger en inblick i etapper annars är svårtillgängliga för mekanistiska studier. Detta modellsystem ger unika möjligheter att studera de molekylära vägar som kontrollerar hjärt härstamning engagemang och cell öde specifikation. Under de senaste åren har förmågan att effektivt generera cardiomyogenic celler från hPSCs förbättrats avsevärt 1-15. Men bland protokoll finns cellinje variation med avseende på effektivitet i att generera cardiomyogenic celler och tidpunkten vid vilken cellerna uttrycker kammarspecifika markörer (t.ex., ventrikeln och Atria). Helst för framtida tillämpningar av denna modellsystem är mer homogena populationer av funktionellt definierade celler önskas. I motsats till tidigare metoder, beskrev cardiomyocyte differentieringsprotokoll här kräver inte cell aggregering eller tillsats av Aktivin A eller benmorfogenesprotein 4 (BMP4) och kraftigt genererar kulturerna mycket positivt för TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v och MLC2a dag 10 celler över testade hittills alla hESC och hiPSC linjer. Strategin är tekniskt enkelt att genomföra, särskilt i jämförelse med tredimensionella kulturer, masskultur, eller embryoid kropp baserade strategier 4-9, och har nyligen definierats i en studie som beskriver en liten molekyl med selektiv toxicitet för hPSCs (Boheler et al. ) 65. Funktioner i detta protokoll omfattar differentiering av hPSCs i enskiktskultur med en enda skikt av en hESC kvalificerad matris (Matrigel), fullt definierade media med små molekyler för att modulera Wnt signalering (liknande, men ändå distinkt från 1,2,7,13), och optimerad flödescytometri färgningsmetoder för utvärdering av differentiering effektivitet och cellidentitet. Sammanfattningsvis fördelarna med detta protokoll jämfört med tidigare rapporter innehåller den kostnads ​​effectiveness, reproducerbarhet, och dess höga effektivitet för att generera cardiomyocytes bland flera HPSC linjer, inklusive hESC och hiPSC linjer. Flödescytometri är ett kraftfullt analysverktyg för att bedöma kvaliteten på celler i odling och bestämma subpopulation homogenitet, och med ordentlig experimentell design kan ge kvantitativa mätningar. Som med alla strategier antikroppsbaserade, korrekt tolkning av experimentella resultat kräver att delar av analys designen inklusive antikroppskoncentrationen och fixering och permeabilization förhållanden (då riktar intracellulära antigener) är noggrant testade för varje antikropp som suboptimala förhållanden påtagligt påverka effektiviteten av antikropp bindning, och därför, tolkning av resultat. Viktigt är, om kvantifiering önskas, monoklonala antikroppar är mycket viktiga, eftersom polyklonala antikroppar kan känna igen multipla epitoper och är benägna att batch-till-batch variation. För närvarande har ett antal olika antikroppar (polyclonal och monoklonala) och färgningsprotokoll har beskrivits för bedömningen av in vitro-differentiering, vilket gör det svårt att jämföra effektiviteten hos cardiomyogenesis bland protokollen 1,2,9,11. Av den anledningen är monoklonala antikroppar som används när tillgängliga för alla flödescytometri analyser. Framöver förväntas det att standardisering av dessa färgningsprotokoll, särskilt med avseende på kvantifiering bör bättre möjliggöra jämförelser mellan differentieringsstrategier. Valet av markörer och deras motsvarande antikroppar, används för att bedöma renheten av in vitro cardiomyogenesis varierar bland rapporter. TNNT2 har ansetts vara en indikator på celler engagerade i cardiomyogenic öde och används rutinmässigt för att bedöma effektiviteten av hjärtdifferentieringsprotokoll. Emellertid är TNNT2 uttrycks också i skelettmuskler under tidig chick och råtta utveckling 16,17 och den är närvarande i human glatt muskulatur 18 </sup&gt;. Således är TNNT2 inte nödvändigtvis en specifik markör för humana cardiomyogenesis in vitro. MLC2v och MLC2a används rutinmässigt som surrogatmarkörer för ventrikulära och förmaks subtyper, respektive. Men utmaningarna med att förlita sig på MLC2v och MLC2a att bestämma cardiomyocyte subtyp i samband med in vitro differentiering uppstår från det faktum att dessa genprodukter inte kan begränsas till en viss kammare hela hjärt utveckling, från hjärtat röret genom vuxen. I gnagare loopas hjärtat är MLC2a mRNA dominerar i förmaks / inflöde tarmområdet och MLC2v mRNA dominerar i de ventrikulära / utflöde regioner. I det kretsade hjärtat, är samtidigt uttryck för MLC2a och MLC2v mRNA observeras i inflödeskanalen, atrioventrikulärt kanalen och utflöde 19,20. Av 3 dagar efter födseln, är MLC2v mRNA begränsad till ventrikeln och med 10 dagar efter födseln, är MLC2a begränsad till förmaken i nyfödda råttor hjärtat 19. Därför tolkningav uppgifter om cardiomyogenesis effektivitet och subtyp identitet får inte bara tänka på närvaron och mängden av referensmarkörnivåer, utan måste ta hänsyn till utvecklingsstadiet (er) till vilka tidpunkter av differentiering som analyseras motsvarar. Detta är särskilt viktigt med tanke på att mognadsstadium cardiomyogenic celler som genereras av in vitro differentiering av hPSCs liknar närmast de av embryonal / fosterutveckling 21-25. Således, förlitar sig på en markörs spatial expression i den postnatala hjärtat inte kan vara lämpliga för bedömning av HPSC-härledda celler, åtminstone i vissa fall. I ett försök att underlätta utvecklingen av mer specifika kriterier för att definiera cardiomyocyte identitet in vitro, är TNNI3 anses vara en värdefull markör för utvärdering cardiomyogenesis in vitro eftersom det är begränsat till hjärtmuskeln under embryogenes i chick och zebrafisk 15,20och är frånvarande i human fetal skelettmuskel 26. Medan TNNI1 är närvarande i humant fetalt hjärta, är TNNI3 den enda TNNI isoformen närvarande i normal vuxen hjärta 27,28. Beträffande cardiomyocyte subtyp identitet, IRX4 29-31 är en informativ markör för celler med en kammar öde. På proteinnivå, har IRX4 nyligen visat sig vara begränsad till ventrikeln från linjära hjärtröret genom neonatal stadier i musen 32. Följaktligen är optimerade färgningsprotokoll för analys av TNNI3 och IRX4 med flödescytometri beskrivits. Såvitt vi vet är detta den första beskrivningen av ett förfarande för effektiv antikroppsbaserad färgning och analys av IRX4 nivåer i humana kardiomyocyter genom flödescytometri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

Det finns ett akut behov av att utveckla metoder för att reparera det skadade hjärtat, upptäcka nya terapeutiska läkemedel som inte har toxiska effekter på hjärta, och förbättra strategier för att exakt modell hjärtsjukdom. Potentialen att utnyttja inducerad teknik mänskliga pluripotenta stamceller (hiPSC) för att generera hjärtmuskeln &quot;i en skål&quot; för dessa tillämpningar fortsätter att generera hög entusiasm. Under de senaste åren har förmågan att effektivt generera cardiomyogenic celler från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) förbättrats avsevärt, erbjuder oss nya möjligheter att modellera mycket tidiga stadier av människans hjärt utveckling annars inte tillgängliga. Till skillnad från många tidigare metoder, beskrev cardiomyocyte differentieringsprotokoll här kräver inte cellaggregation eller tillsats av Aktivin A eller BMP4 och robust genererar kulturer av celler som är mycket positiv för kardiellt troponin I och T (TNNI3, TNNT2), iroquois- klass homeodomän-proteinIRX-4 (IRX4), myosin reglerande lätt kedja 2, ventrikulära / hjärtmuskeln isoform (MLC2v) och myosin reglerande lätt kedja 2, förmaks isoform (MLC2a) vid dag 10 i alla mänskliga embryonala stamceller (hESC) och hiPSC linjer testade enligt datum. Celler kan passe och underhållas under mer än 90 dagar i odling. Strategin är tekniskt enkelt att genomföra och kostnadseffektiv. Karakterisering av cardiomyocytes härrör från pluripotenta celler innehåller ofta analys av referensmarkörer, både på mRNA och proteinnivå. För proteinanalys, flödescytometri är ett kraftfullt analysverktyg för att bedöma kvaliteten på celler i odling och bestämma subpopulation homogenitet. Däremot kan teknisk variation i provberedning påtagligt påverka kvaliteten på flödescytometri uppgifter. Därför bör standardisering av färgningsprotokoll underlätta jämförelser mellan olika differentieringsstrategier. Följaktligen optimerad färgningsprotokoll för analys av IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 och TNNT2 med flödescytometri beskrivs.

På dag 0, celler är 100% sammanflytande med kompakt morfologi och minimal cellrester. På dagarna 1-2, är det vanligt att observera betydande celldöd (40-50%), men bifogade celler behåller kompakt morfologi (Figur 1A). Under denna tid, är media orange och grumlig. Pink medier tyder driven celldöd, och i detta fall, bekräfta med trypanblått och avbryta om celldöd överstiger 70%. Celler kommer återhämta sig under dagarna 3-4 och densiteten ökar. Under dagarna 5-6, inträffar minimal celldöd...

Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Artikeln beskriver detaljerad metod för att effektivt differentiera humana pluripotenta stamceller till kardiomyocyter genom att selektivt modulera Wnt pathway, följt av flödescytometrianalys av referensmarkörer för att bedöma homogenitet och identitet av befolkningen.

High Efficiency Differentiering av Human pluripotenta stamceller till Cardiomyocytes och karakterisering av flödescytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera humana med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektering och Nucleofecting Human inducerade pluripotenta stamceller

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analys av cellsuspensioner Isolerade från fasta vävnader från Spectral flödescytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Hög genomströmning mätning av Dictyostelium discoideum Macropinocytosis av Flow flödescytometri

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Mätning av mitokondriell massa och membran potential i hematopoietiska stamceller och T-celler med flödescytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Enkel extracellulär vesikeltransmembranproteinkarakterisering genom nanoflödescytometri

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...