Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

Bu araştırma NIH 4R00HL094708-03 tarafından desteklenen, AİG&#39;nin Araştırma İşler Komitesi Yeni Fakülte Ödülü, ve Wisconsin Medical College (RLG) de Kern vakıf (başlangıç ​​fonları); Hong Kong Tema tabanlı Araştırma Şema T13-706 / 11 (KRB) Araştırma Hibeler Konseyi; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, ve AHA Araştırmacı Ödülü (JCW) Kuruldu; AHA Doktora Sonrası Araştırma Bursu 12POST12050254 (PWB). Biz veri toplama ve yazının dikkatli inceleme ile yardım için Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü Sitometrisi Çekirdeği Umut Campbell teşekkür ederim.

1. Çözüm ve Medya Hazırlık <ol><li> HESC Nitelikli Matrix Kaplama Stok Çözüm <ol><li> Yavaşça bir gece boyunca 4 ° C&#39;de HESC buz üzerinde nitelikli matrisi (5 mi) eritin. 1.5 ml steril, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpler içine hacimde dağıtın ve hemen -20 ° C&#39;de saklayın. Not: tüm bölenin hacmi çok dayanmaktadır ve tipik haliyle 270-350 ul aralığında değişir. İmalatçı Adım 2.1 &#39;de tarif edildiği gibi 25 ml seyrelmesi üzerine 1x konsantrasyon elde etmek iç...

Farklılaşma protokolün başarısına için kritik farklılaşma başlamadan önce en az beş geçişler için tek hücre düzeyinde pasajlanmışlardır edilmiştir hPSCs kaliteli kültürlerinin kullanılmasıdır. Bunlar hücre hattı bağımsız farklılaşma başlangıcında% 100 konfluent, eğer benzer farklılaşma verimleri bilinen muhtelif hPSC hatlar arasında görülmektedir. Farklılaşma başlangıcında hücre kaynaşması ≤95 veya%&gt;% 100 ise, optimumun altında verimliliği görülmektedir. Bu yüz...

HESC ve hiPSC dahil hPSCs, ikinci kardiyomiyositlerde oluşmasından mekanik çalışmalar için başka şekilde erişilemez aşamalarında fikir veren çok erken insan kardiak gelişimsel süreçlerinin bir in vitro model olarak işlev görebilir. Bu model sistem kalp soy bağlılığı ve hücre kaderinin şartname kontrol moleküler yolları incelemek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Son yıllarda, etkili hPSCs ikinci cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde 1-15 iyileşmiştir. Bununla birlikte, protokolleri arasında hücreler oda özgü belirteçleri (örneğin, ventrikül ve kulakçıklar) ifade eden hücreler de cardiomyogenic ve zamanlama üreten verimliliğine göre hücre çizgisi farklılıklar vardır. İdeal olarak, bu model sisteminin gelecek uygulamalar için, fonksiyonel olarak tanımlanmış hücrelerin daha homojen popülasyonları arzu edilir. Önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü ce gerektirmez, burada açıklananII toplanmasını ya da sağlam bir aktivin veya Kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve ekleme gün TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v ve MLC2a için kültürlerinden pozitif bugüne kadar test edilen bütün HESC ve hiPSC hatları üzerinden 10 hücreleri oluşturur. Bu strateji, özellikle üç boyutlu kültürler, kitle kültürü veya vücut embriyoit bazlı stratejilerin 4-9 ile karşılaştırıldığında, uygulamaya teknik olarak basittir ve son hPSCs seçici toksisite ile küçük bir molekülü tarif etmektedir bir çalışmada (Boheler ve ark tanımlandı. ) 65. Bu protokolün özellikleri, küçük molekülleri kullanarak tam olarak tanımlanmış bir ortam (fakat farklı 1,2,7,13, benzer bir şekilde,), Wnt sinyal modüle etmek üzere bir yetkili HESC matrisi (Matrigel) oluşan tek bir tabaka kullanılarak tek katmanlı kültürü içinde hPSCs farklılaşmasını içermektedir ve farklılaşma verimlilik ve hücre kimliğinin değerlendirilmesi için boyama yöntemleri sitometri optimize edilmiş akış. Önceki raporlar maliyet-etkiliğin dahil Özetle, bu protokolün avantajları karşılaştırıldıeness, tekrarlanabilirlik ve HESC ve hiPSC hatları dahil olmak üzere birden hPSC hatları arasında yer kardiyomiyositlerin üretmek için yüksek verimlilik. Flow sitometri kültür hücrelerin kalitesini değerlendirmek ve subpopülasyonu homojenlik belirlenmesi için güçlü bir analitik araçtır, ve uygun deneysel tasarım, kantitatif ölçümler sağlayabilir. Tüm antikor bazlı stratejiler gibi, deneysel sonuçların doğru yorumlanması alt-optimal koşulları belirgin antikor verimini etkileyen gibi antikor konsantrasyonunun ve tespit ve permeabilizasyon koşulları (hücre içi antijenler hedefleme dahil) tahlil tasarım unsurları dikkatle her antikor için test gerektirir , sonuçların yorumlanması bağlanması ve bu nedenle. Niceleme gerekli ise, poliklonal antikorlar, çok epitopu tanıyan ve partiden partiye değişkenlik eğilimli gibi Önemli olarak, monoklonal antikorlar, gereklidir. Şu anda, çeşitli antikorlar, (POlyclonal ve monoklonal) ve boyama protokolleri zor protokoller arasında 1,2,9,11 cardiomyogenesis verimliliğini karşılaştırmak çok in vitro farklılaşma değerlendirilmesi için tarif edilmiştir. Tüm akış sitometresi analizleri için kullanılabilir Bu nedenle monoklonal antikorlar kullanılır. İleriye, daha iyi farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırma izin vermelidir, özellikle kantitatif getirmedi, bu boyama protokollerin standartlaştırılması bekleniyor. In vitro olarak cardiomyogenesis saflığını değerlendirmek için kullanılan belirteçler seçimi ve bunlara karşılık gelen antikorlar, raporlar arasında değişir. TNNT2 cardiomyogenic kaderine işlenen hücrelerin bir göstergesi olarak kabul edilmiş ve rutin olarak kalp farklılaşma protokolleri etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, aynı zamanda, erken TNNT2 piliç ve sıçan gelişim 16,17 sırasında iskelet kası olarak ifade edilir ve insan düz kas 18 içinde mevcut olmaktadır </sup&gt;. Böylece, TNNT2 zorunlu in vitro olarak insan cardiomyogenesis özel bir molekül değildir. MLC2v ve MLC2a rutin olarak, sırasıyla, ventriküler ve atriyal alt tiplerinin temsili gösterge olarak kullanılır. Bununla birlikte in vitro farklılaşma bağlamında kardiyomiyosit alt-tipini belirlemek ve MLC2v MLC2a güvenerek zorluklar bu gen ürünleri, yetişkin yoluyla kalp tüp, kalp gelişimi boyunca belirli bir bölmeye sınırlı olmayabilir gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Kemirgen kalp döngüye yılında MLC2a mRNA atriyal / içeakımın alanda baskın ve MLC2v mRNA ventrikül / çıkış yolu bölgelerde yaygındır. Ilmekli kalbinde, MLC2a ve MLC2v mRNA&#39;larının birlikte ifadesi giriş yolu, atriyoventriküler kanal ve çıkış yoluna 19,20 görülmektedir. Doğumdan sonra 3 gün boyunca, MLC2v mRNA ventriküle sınırlıdır ve doğumdan sonra 10 gün, MLC2a neonatal sıçan kalbinde kulakçıklar 19 ile sınırlandırılmıştır. Bu nedenle, yorumlamacardiomyogenesis etkinlik ve alt-tipi kimlik sadece referans markeri seviyelerinin varlığını ve miktarını dikkate gerekir, ancak incelendiğinde farklılaşma edilen zaman noktalarından karşılık gelişimsel aşama (lar) dikkate almalıdır ilişkin verilerin. Bu hPSCs in vitro farklılaşma tarafından üretilen cardiomyogenic hücrelerin olgunlaşma aşaması en yakın, embriyonik / fetal gelişim 21-25 benzer olanlar göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Bu nedenle, doğum sonrası kalp bir işaretin mekansal ifade dayanarak, en azından bazı durumlarda hPSC türetilen hücrelerin değerlendirilmesi için uygun olmayabilir. In vitro kardiyomyosit kimliklerini tanımlamak için daha spesifik kriterler geliştirilmesini kolaylaştırmak için bir çaba, TNNI3 o civciv ve Zebra balığı 15,20 embriyogenezis boyunca kalp kasının sınırlı olarak in vitro cardiomyogenesis değerlendirmek için değerli bir belirteç olarak kabul edilirve insan fetusu iskelet kası 26 yoktur. TNNI1 insan cenin kalbi mevcut iken, TNNI3 normal yetişkin kalp 27,28 tek TNNI izoformu mevcuttur. Kardiyomyosit alt tip kimliğine ilişkin, Irx4 29-31 ventriküler kaderi ile hücrelerin bilgilendirici bir belirtecidir. Protein düzeyinde, Irx4 son fare 32, neonatal aşamalardan doğrusal kalp tüpten ventriküle sınırlı olduğu gösterilmiştir. Bu duruma göre, akış sitometrisi ile analiz TNNI3 ve Irx4 için optimize boyama protokolleri açıklanmıştır. Bildiğimiz kadarıyla, bu akış sitometrisi ile etkin bir biçimde antikor bazlı boyama ve insan kardiyomiyositlerde Irx4 seviyesini ölçmek için bir yöntem, ilk tanımlamasıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

, Hasarlı kalp tamir kalp üzerinde toksik etkileri yoktur yeni tedavi ilaçlar keşfetmek ve doğru kalp hastalığı modellemek için stratejiler geliştirmek için yaklaşımlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu uygulamalar için &quot;bir tabak içinde&quot; kalp kası oluşturmak amacıyla insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisini istismar potansiyeli yüksek coşku oluşturmak için devam ediyor. Son yıllarda, verimli insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) den cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde aksi erişilebilir değil, insan kardiyak gelişiminin çok erken aşamalarında modellemek için bize yeni fırsatlar sunan geliştirdi. Birçok önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü hücresi toplanmasını ya da A ya da aktivin BMP4 eklenmesini gerektirmeyen, burada açıklanan ve güçlü bir kardiyak troponin için yüksek seviyede pozitif olan hücre kültürleri üretir I ve T (TNNI3, TNNT2), iroquois- sınıf Homeodomain proteiniIRX-4 (Irx4), miyozin düzenleyici hafif zincir 2, ventriküler / kalp kası izoformu (MLC2v) ve miyozin düzenleyici hafif zincir 2, tüm insan embriyonik kök hücre (HESC) ve hiPSC hatları üzerinden 10 günde atriyal izoformu (MLC2a) için test tarihi. Hücreler geçirildi ve kültür içinde en fazla 90 gün muhafaza edilebilir. Strateji teknik uygulamak için basit ve maliyet-etkin. Pluripotent hücreler türetilen kardiyomiyositlerin karakterizasyonu genellikle mRNA ve protein seviyesinde, her ikisi de referans işaretlerinin analizini içermektedir. Protein analizi için, akış sitometrisi, kültürdeki hücre kalitesinin ve alt popülasyonu homojenliğinin saptanması için güçlü bir analitik araç olduğunu. Ancak, numune hazırlama teknik varyasyon anlamlı veri akış sitometri kalitesini etkileyebilir. Böylece, boyama protokolleri standardizasyon çeşitli farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmalıdır. Bu duruma göre, Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 ve TNN analizi için boyama protokolleri optimizeAkış sitometri T2 açıklanmıştır.

0. günde, hücreler, kompakt morfolojisi ve hücre döküntüleri en az% 100 birleşik bulunmaktadır. Günlerde 1-2, anlamlı hücre ölümünü (% 40-50) gözlemlemek için ortak, ancak ekli hücreleri kompakt morfoloji (Şekil 1A) muhafaza edecektir. Bu süre boyunca, medya portakal ve bulanıktır. Pembe ortam aşırı hücre ölümünü göstermektedir ve bu durumda, tripan mavisi ile teyit Hücre ölümü ve% 70 aşarsa bırakmaktadır. Hücreler gün 3-4 esnasında kurtarmak ve yoğunluk artacak...

Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...