Name: real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00
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この研究は、国立衛生研究所からの助成金RO1 CA 135561、R01 CA151494、R01 CA174432およびP3013330によってサポートされていました。 私たちは、陰窩単離プロトコールを開発する上で彼らの貴重なコメントミケーレヒューストン、エレナDhima博士アンナVelcichに感謝したいと思います。 我々はまた、直接、それぞれ、タツノオトシゴ施設を運営糖尿トレーニングおよびNIH P60DK20541でサポートされているアルベルト·アインシュタイン医学校の研究センター、博士マイケル·ブラウンリー博士と雪-梁デュを、感謝します。

この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って行った。プロトコルは、アルベルト·アインシュタイン医学校の動物実験の倫理委員会によって承認された。 1.陰窩単離および培養<ol><li>小腸から陰窩の単離： <ol><li>関心のある任意のマウスモデルから腸陰窩を分離します。頸椎脱臼に続いてCO 2を持つマウスを安楽死させる。 <...

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

我々は、カルボニルシアニド、基礎速度の測定後、陰窩代謝オリゴマイシンを添加することにより評価した。ex vivoで 8ヶ月齢のマウスから単離した陰窩の酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）を試験し、オルガノイドに成長順次-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）およびロテノン、。 29分（ 図2Aおよび2B） - OCR基底および基底ECAR ...

結腸直腸癌（CRC）は、米国における癌関連死亡原因の第3位である。それが人生の後半で生じたすなわち （&gt; 50歳）と、明確な素因遺伝因子を持つ- -散発大腸癌強く、長期的食事パターン1,2の影響を受けて発生率が全症例の〜80％ ​​を占め、。これらの腫瘍は、腫瘍細胞増殖3-5の高率を可能にし、おそらく駆動するために部分的に（グルタミノリシスを介して）利用可能な細胞のビルディングブロックとエネルギーのより高い濃度を行うことがワールブルク効果として知られている酸化的解糖への依存性に向けた代謝シフトを呈する。小腸癌を含む大腸癌の研究、ならびに他の胃腸癌は、腫瘍形成の原因に重要な洞察を提供する。 DETのを支援することができる胃腸器官系の、通常のプロ腫瘍形成及び腫瘍形成状態間の代謝の違いを調査腫瘍発生の相対リスクだけでなく、新生物の早期発見のermination。また、ミトコンドリア呼吸と解糖が関与する生体エネルギー代謝を理解することは、細胞生理学、老化や病気の状態が腸の恒常性を乱す方法に根本的な洞察を提供します。細胞外フラックス解析のための生体エネルギーアッセイ技術の利用は、リアルタイムで6,7、培養中で増殖する細胞で同時にミトコンドリアの呼吸と解糖の速度を評価することができます。 最近まで、小腸のin vitro試験で 8,9良性または悪性のいずれかの腫瘍由来の細胞株に限定されていましたし、正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。 2009年には、佐藤らは 、10は、3次元（3D）マウス腸管上皮オルガノイド、またはepithを成長させるex vivoで培養システムを導入、実験的な診断および治療 ​​の研究10,11に適しelial「ミニ根性」、。また、カロリー制限されたマウスから単離された陰窩は、このような培養物12におけるオルガノイドとしての改変された成長特性を維持する。形質転換細胞株と比較して、陰窩オルガノイド培養物は、 インビボでの状態を理解することがはるかに優れたモデルを提示し、生理学的に関連するデータを生成するために使用することができる。 我々は、腸陰窩オルガノイドのエネルギー代謝をアッセイするために生体エネルギー分析技術に適合。マウス腸の陰窩オルガノイドは、提示さ陰窩オルガノイドエネルギー代謝研究を開発するためにex vivoで培養した。陰窩オルガノイドの酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）の非存在下および存在下つの異なる代謝阻害剤（オリゴマイシン、ロテノン）のイオンキャリア（カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）で測定した。陰窩orgaがこれらの化学化合物へのNOID代謝反応が正常に変化ECARとOCRの値を通して反映された。 セルラー生体エネルギー研究は、癌、肥満、糖尿病、代謝性疾患およびミトコンドリア病で代謝状態および疾患リスクと表現型の間の相互の相互作用を解明および翻訳医学のための直接的な意味合いを持つ事前スクリーニング方法を助ける。ここでは、小腸陰窩を分離し、培養陰窩オルガノイドにするための詳細なプロトコルを記述します。また、我々は、代謝アッセイのためのcryptオルガノイドの文化を使用するための新規な方法をご紹介します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1633">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">356231</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">20012-027</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Advanced DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12634-028</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D5030</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Phenol Red sodium salt&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P4758</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15240-062&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X or 2 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Penicilin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15140-122</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">35050061</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15630-080</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">N-Acetyl-L-Cysteine, 25g</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A9165-25G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">100X N-2 supplement, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">50X B-27&#174; supplement minus Vitamin A, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12587-010</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug</td>
			<td style="width:229px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3474-RS-050&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 500 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine EGF, 100ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">315-09&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 50 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine Noggin, 20ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">250-38</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 100 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">25030-081</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; Glucose powder</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15023-021</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Ambion&#174; 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">AM9260G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">DTT (Dithiothreitol), 1M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P2325</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A2058</td>
			<td style="width:456px;">0.1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">16000-044</td>
			<td style="width:456px;">1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recovery&#8482; Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12648-010</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">ROCK inhibitor (Y-27632)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">Y0503</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">O4876</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C2920</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Rotenone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R8875</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">221465</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 0.1 N in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td>
			<td style="width:229px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

腸管腔に突出し、絨毛および成熟した腸細胞、杯細胞および腸内分泌細胞から成る;小腸粘膜は、2つの基本的な構造に編成され、繰り返しのアーキテクチャを示し、及び陰窩、粘膜下層および筋の近位に常駐成体幹細胞および前駆細胞を保有し、パネート細胞成熟、ならびに間質および陰微小環境の免疫細胞。ここ数年までは、小腸のin vitro試験で 、良性または悪性のいずれかで腫瘍に由来する細胞株に限定されていた、と正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。ここでは、佐藤らから適応する方法を実証している。（2009）C57BL / 6マウス由来の初代マウス腸陰窩オルガノイドを培養する。さらに、メジャーによってリアルタイムに陰窩代謝プロファイルをアッセイする陰窩オルガノイド培養物の使用を提供する基礎酸素消費、解糖率、ATP産生および呼吸容量のメント。オルガノイドは、それらのソースで定義された特性を維持し、酸素消費量と細胞外酸性化率で反射されたそれらの代謝適応の側面を保持している。この陰窩オルガノイド培養系におけるリアルタイム代謝研究は、陰窩オルガノイドエネルギー代謝を研究するための強力なツールであり、それは、栄養および薬理学的因子によって調節することができる方法。

墓所オルガノイドは、8ヶ月齢のC57BL / 6マウスから樹立し、栄養76A（AIN76A）の齧歯類ダイエットアメリカの協会で精製供給した。腸の陰窩オルガノイドは、単一のcrypt（ 図1A、シングル赤矢印）から長期間培養で増殖させることができる。オルガノイド培養物（ 図1B、赤い矢印）で18-20日で暗号のような構造を成長させる。陰窩は3週間毎に継代し、オルガノイドを効率...

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

における代謝プロファイルのリアルタイム分析<em&gt;エクスビボ</em&gt;マウス腸陰窩オルガノイド培養

小腸の陰窩オルガノイド培養ex vivoで幹細胞およびそれらのニッチに依存する陰窩の成長を再現する組織培養系を提供する。私たちは、初代マウス陰窩オルガノイドリアルタイムで代謝プロフィールをアッセイする方法を確立した。私たちは、オルガノイドは、それらのソースで定義された生理学的特性を維持した。

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

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初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

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Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

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の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

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腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

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Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

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リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

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Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

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