Name: stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
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This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Le modèle d&#39;ischémie cérébrale présenté ici donne volumes d&#39;infarctus hautement reproductibles déterminées 24 à 48 h et 7 jours après la ligature MCA par différentes approches 8,15,17. Ce modèle MCAO a un faible taux de mortalité (moins de 1%) par rapport aux autres, en minimisant le nombre d&#39;animaux utilisés dans les études. Une étape cruciale pour obtenir ce taux de mortalité est faible pour maintenir des conditions aseptiques appropriées pour éviter les infections qui pourraient nuire à la survie après un AVC induction. Ce modèle MCAO peut non seulement être utilisé comme un modèle MCAO permanente, qui est considéré comme un modèle pertinent clinique pour la recherche translationnelle 18, mais aussi comme un modèle transitoire par ligature transitoire de la CCA et le MCA avec un nœud coulant et la reperfusion postérieure à l&#39;heure souhaitée 19. Cette méthode a été utilisée avec succès chez la souris et le rat 17,20. Toutes ces preuves indique que MCAO par ligature est un modèle polyvalent de haute de l&#39;ischémie cérébrale avec de multiples applications. Un Critical étape de cette technique est qu&#39;elle nécessite une intervention chirurgicale invasive sous un stéréomicroscope; la craniotomie doit être effectuée très soigneusement pour ne pas endommager l&#39;os zygomatique ainsi que la MCA. Cependant, l&#39;utilisation d&#39;animaux fictifs (qui sont soumis à la procédure chirurgicale, mais CCA et MCA ligature ne est pas effectuée) fournit un outil utile pour distinguer les effets de la procédure dépendante chirurgicales. L&#39;étendue de la lésion cérébrale suivant cette technique peut être quantifiée par plusieurs méthodes. Notre protocole de cerveau sectionnement, coloration de Nissl et estimation ultérieure du volume de Cavalieri permet une quantification précise de la zone endommagée et minimise le nombre de souris utilisées dans ce type d&#39;études depuis des coupes de cerveau en série peuvent également être utilisés pour l&#39;analyse immunohistochimique différente. Pour une meilleure performance de cette méthode, il est essentiel de choisir les paramètres appropriés utilisés dans le logiciel de stéréologie (tableau 1) qui sera nécessaire pour estimer evolume de e des différentes régions par la formule: V = 1 / ssf * a f * t * ΣP i (SSF est la fraction tranche d&#39;échantillonnage, t est l&#39;épaisseur moyenne des sections, un f est la zone de l&#39;espacement de la grille et ΣP le nombre de points de frapper la structure). Le MCAO distale par ligature peut être utile pour caractériser le leucocyte infiltré et sous-populations de cellules immunitaires 8,13 qui participent dans le processus inflammatoire qui suit une lésion cérébrale 1-4. Ici, nous proposons deux méthodes différentes pour la caractérisation des cellules immunitaires du cerveau, une approche stéréologique précis et une analyse de cytométrie en flux pour mieux caractériser plusieurs sous-populations de leucocytes. Profitant de série cerveau sectionnement, la quantification du nombre total de neutrophiles peut être obtenue par le procédé de fractionnement optique 16, qui estime le nombre total de cellules à partir du nombre de cellules wit échantillonnéha systématique échantillonnés au hasard (SRS) ensemble de impartiales espaces de comptage virtuelles couvrant l&#39;ensemble de la région d&#39;intérêt, dans notre cas, la région de l&#39;infarctus, avec une distance entre impartiales espaces de comptage virtuelles uniforme dans les directions X, Y et Z. Cette méthode fournit un outil précis pour estimer le nombre total de neutrophiles dans le cerveau ischémique à différents moments après la ligature. Même se il n&#39;a pas été démontré dans cette étude, ce protocole peut également être utilisée pour l&#39;estimation des différentes sous-populations de neutrophiles après une ischémie 21 et pour une quantification précise de toute autre population de cellules dans le cerveau ischémique comme les autres leucocytes infiltrés (monocytes / macrophages) et aussi pour estimer neurones survivants ou même pour la neurogenèse quantification après un AVC. L&#39;étape la plus importante pour une estimation précise de la zone souhaitée est le choix des paramètres appropriés, comme ceux indiqués dans le tableau 3 pour la quantification des neutrophiles dans la zone ischémique.Ces paramètres seront utilisés pour le logiciel de stéréologie pour calculer le nombre total de cellules positives (N) en utilisant l&#39;équation N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- est le nombre total de cellules comptées avec la colonne de fractionnement, SSF est la fraction d&#39;échantillonnage de la section, asf est la zone de fraction d&#39;échantillonnage et TSF est l&#39;épaisseur de la fraction d&#39;échantillonnage) 5. Bien que cette méthodologie est plus lent que les autres techniques de quantification (par exemple, l&#39;analyse de marqueurs de neutrophiles par mg de tissu, la densitométrie des images ou le nombre de neutrophiles par champ représentatives), il a l&#39;avantage d&#39;être un neutre et une technique solide qui fournit une précision quantification du nombre de cellules. La méthode d&#39;isolement des leucocytes cerveau permet une identification et quantification simultanée de plusieurs sous-types de cellules immunitaires sans avoir à solliciter le système de coloration in vivo ou manipulations génétiques. Après le tri cellulaire à partir de la p myéloïde caractériséopulations ou leur séparation immunomagnétique peuvent être utilisés pour de multiples applications en aval, tels que d&#39;autres études sur expression génique ou protéique. La caractérisation précise de neutrophiles, monocytes et la microglie obtenus avec cette méthode fournit une grande spécificité par rapport aux méthodes existantes telles que les études immunohistochimiques, un avantage qui permet l&#39;attribution des fonctions spécifiques aux différentes cellules myéloïdes qui interviennent dans le cerveau réponse immunitaire innée. En outre, il peut être étendu pour caractériser d&#39;autres populations du cerveau avec l&#39;étiquette appropriée, comme sanguins né macrophages (CD11b + CD45 + CD68 salut), et il peut être appliqué pour l&#39;étude d&#39;autres pathologies du système nerveux central ou des blessures. Par conséquent, cette technique fournit un outil essentiel d&#39;explorer l&#39;hétérogénéité de la réponse inflammatoire dans le cerveau. Une limitation principale de cette technique réside dans la préparation des suspensions de leucocytes à partir de tissu cérébral frais, ce qui peut altérer laétat d&#39;activation des cellules ou leur modification antigène. Bien que cette technique permet une caractérisation qualitative plus détaillée par rapport à des études immunohistochimiques, il fournit une quantification moins précise basée sur l&#39;isolement des cellules. Malgré cela, l&#39;efficacité de notre protocole d&#39;isolement des cellules est similaire à d&#39;autres méthodes publiées 9 et il peut être efficacement utilisé pour détecter des différences dans le nombre de cellules immunitaires cérébrales entre les groupes témoins et MCAO ou même entre les groupes MCAO soumis à différents traitements 8. Les étapes critiques de ce protocole sont la dissection des tissus, la procédure d&#39;interruption de tissus, et la suppression de la myéline. En ce qui concerne le recueil de tissu, une étape de normalisation peut être inclus (en pesant le tissu collecté) pour éviter la variabilité due à différentes performances de dissection. En outre, la normalisation entre les différents groupes MCAO peut également se produire par volume de l&#39;infarctus (préalablement déterminée par magnétique Resonance). Une autre façon de résoudre ce problème est d&#39;utiliser l&#39;ensemble de l&#39;hémisphère ipsilatéral des deux groupes ischémiques et de contrôle, ou même utiliser l&#39;hémisphère controlatéral de la souris ischémique comme un contrôle de minimiser le nombre d&#39;animaux utilisés. Bien que cette approche permet d&#39;éviter des différences entre chaque dissection, elle a un inconvénient majeur; un facteur de dilution est ajoutée en augmentant le nombre total de cellules, mais pas le nombre de cellules myéloïdes qui sont exclusivement situées dans la zone centrale et les zones péri-infarctus du cortex ipsilatéral. En ce qui concerne la perturbation des tissus, ce protocole illustre les étapes de la rupture mécanique des cellules du cerveau, en évitant les traitements enzymatiques et la prévention antigène de surface altération 9,22, une question essentielle pour la poursuite analyse qualitative et quantitative des sous-populations de cellules inflammatoires. En plus de la préparation de la suspension de cellules d&#39;intérêt, l&#39;enlèvement de la myéline à partir d&#39;échantillons de cerveau est une étape très recommandée pour éviter les interférences avec downstapplications rame, comme la séparation immunomagnétique ou cytométrie de flux 23,24. Ceci peut être réalisé en utilisant différentes méthodes, comme le saccharose ou gradients de Percoll ou perles anti-myéline. Ici, et basée sur des études antérieures qui comparent différentes méthodes pour l&#39;isolement de suspension des cellules du cerveau, une rupture mécanique en combinaison avec l&#39;utilisation de Percoll pour enlever la myéline est utilisé pour améliorer les rendements et la viabilité cellulaire 25.

Morphologiques, phénotypiques et d&#39;expression génique des altérations de la microglie, ainsi que extravasation et l&#39;activation des macrophages et des neutrophiles hématogènes sont soupçonnés de jouer un rôle central dans la cascade physiopathologique suivante lésion cérébrale 1-4. Ce protocole fournit deux approches pour estimer le nombre de différents sous-ensembles de cellules myéloïdes du cerveau ischémique et pour effectuer leur caractérisation phénotypique. En outre, il fournit également une description d&#39;un modèle expérimental d&#39;ischémie cérébrale chez les souris, qui consiste en la ligature transitoire ou permanent à la fois distale Artère cérébrale moyenne (MCA) et l&#39;artère carotide commune (CCA), y compris la façon d&#39;évaluer l&#39;infarctus par la méthode Cavalieri précise en utilisant un logiciel stéréologique. La première approche pour caractériser des sous-ensembles de cellules myéloïdes du cerveau ischémique est une méthode stéréologique basé sur l&#39;approche de fractionnement optique 5. Ce est le pluscouramment utilisé sonde stéréologique en sciences de la vie et fournit un degré élevé de précision avec de faibles coefficients d&#39;erreur 5-7. Ce est le meilleur choix pour la quantification de cellules lorsque le tissu est coupé en sections, car elle évite les biais sur l&#39;estimation de la cellule en raison de la fragmentation du tissu en sections. Cette méthode est un moyen très puissant pour caractériser numéros, la dynamique et les changements phénotypiques des sous-populations de neutrophiles infiltrés du tissu ischémique 8. La seconde approche de caractérisation est basée sur un protocole modifié à partir de Campanella et collaborateurs 9 qui fournit un moyen simple pour isoler cerveau suspensions de leucocytes et de les caractériser par cytométrie de flux. Contrairement aux techniques immunohistochimiques classiques, la cytométrie en flux caractérisation permet de différencier entre la microglie (CD45 lo CD11b +) et infiltré cellules myéloïdes (CD45 salut CD11b +) en fonction de leur diffles niveaux d&#39;expression de CD45 Ørente 9-13. En outre, les monocytes pro-inflammatoires (CD45 salut CD11b + Ly-6G - Ly-6C salut), les neutrophiles (CD45 salut CD11b + Ly-6G +) et d&#39;autres sous-ensembles de leucocytes le tissu ischémique peuvent être distinguées. Cette approche fournit un test fiable et rapide pour évaluer la neuro-inflammation dans des modèles expérimentaux de l&#39;ischémie cérébrale. Cependant, le traitement des tissus peut influencer l&#39;état d&#39;activation et le nombre des différentes populations de cellules présentes dans le tissu ischémique fournir une caractérisation semi-quantitative.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

activation de cellules microgliales, ainsi que l&#39;extravasation des macrophages et des neutrophiles hématogènes, est censée jouer un rôle central dans les lésions cérébrales après un AVC. Ces sous-populations de cellules myéloïdes peuvent afficher différents phénotypes et fonctions et doivent être distingués et caractérisé pour étudier leur réglementation et leur contribution à des lésions tissulaires. Ce protocole prévoit deux méthodes différentes pour le cerveau immunitaire caractérisation des cellules: une approche stéréologique précis et une analyse de cytométrie en flux. L&#39;approche stéréologique est basé sur la méthode de fractionnement optique, qui calcule le nombre total de cellules dans une zone d&#39;intérêt (cerveau infarci) estimée par un échantillonnage aléatoire systématique. La seconde approche de caractérisation fournit un moyen simple pour isoler des suspensions cerveau de leucocytes et de les caractériser par cytométrie de flux, ce qui permet la caractérisation de la microglie, les monocytes et les neutrophiles infiltré du tissu ischémique. En outre, il a également DÉTAILS un modèle d&#39;ischémie cérébrale chez les souris qui affecte exclusivement cortex cérébral, infarctus générer hautement reproductibles avec un faible taux de mortalité, et la procédure de traitement du cerveau histologique pour caractériser volume de l&#39;infarctus par la méthode Cavalieri.

Le modèle d&#39;ischémie cérébrale représenté ici génère infarctus vus exclusivement dans le cortex sans affecter le tissu striatal lenticulostriatal depuis les branches de la MCA qui irriguent le striatum ne sont pas obstrués (figure 1). Par coloration de Nissl, la zone endommagée peut être identifié comme une zone corticale hypochrome (Figure 2). Ce modèle est caractérisé par des volumes d&#39;infarctus hautement reproductibles 24 h après MCAO (% IH 15,89 ± 0,28) estimée par la méthode Cavalieri dans les sections Nissl colorées (Figure 2). Estimation du volume infarci par le procédé Cavalieri est une approche précise avec une erreur faible qui se traduit par le coefficient d&#39;erreur (CE) de Gundersen dans les hémisphères contralésionnel et ipsilésionnelle ainsi que dans la zone infarcie (tableau 2). Volume de tissu endommagé peut être exprimé en mm 3, mais également en% selon la formule suivante: H dans la section 3.2.13. En outre, l&#39;estimationdu volume total des régions ipsilésionnelle contralésionnel et permet le calcul de l&#39;indice de l&#39;oedème de corriger le volume infarci et pour éviter une surestimation du tissu endommagé (tableau 2). Étant donné le traitement de sectionnement de série du tissu cérébral, ce qui peut être mis à profit pour effectuer une estimation précise du nombre total de sous-populations de cellules, comme les neutrophiles infiltrés, dans la zone ischémique, en utilisant l&#39;approche de fractionnement optique (figure 3 et tableau 4) avec les paramètres indiqués dans le tableau 3. Ce protocole estime un nombre total de neutrophiles (cellules Ly6G-positifs) dans la zone infarcie de 23 328 ± 3623 à 24 h et de 82 856 ± 8143 à 48 h chez la souris après pMCAO (Figure 3D). En accord avec des études précédentes, l&#39;infiltration des neutrophiles est directement corrélée avec la taille de l&#39;infarctus (figure 3E). Estimation de la til nombre de neutrophiles par le procédé de fractionnement optique est une approche précise avec une erreur faible qui est réfléchie par le CE de Gundersen (tableau 4). L&#39;isolement des leucocytes et la cytométrie de flux de protocole de caractérisation permet l&#39;isolement de 47 922 ± 23 174 cellules myéloïdes de la corticale de l&#39;hémisphère ipsilésionnelle de souris ischémiques. Celui-ci comprend 10 à 30% du total des événements présents dans la suspension de cellules. La grande majorité des événements capturés à l&#39;aide de ce protocole présente un paramètre FSC bas, associé à des débris cellulaires (figure 4). CD11b coloration montre que les cellules CD11b + ont une valeur FSC ultérieure (figure 4), ce qui suggère que les débris de cellule ne est pas marqué avec cette borne et, comme indiqué précédemment, qu&#39;il ne peut être exclu d&#39;une analyse complémentaire en définissant le seuil FSC à 200 9. Le montant variable de débris cellulaires obtenus avec cette méthode suggère que les différences sur le processus de l&#39;échantillonING (calendrier, la conservation des tissus, la température de l&#39;échantillon, une élimination efficace de la myéline, etc.) peut rendre compte. En outre, l&#39;utilisation de filtres de cellules est également nécessaire pour éviter la présence de pinces dans les échantillons cellulaires; cette étape doit être fait avant la coloration de la cellule. En utilisant la stratégie de déclenchement représentée sur la figure 5 qui est basé sur l&#39;expression de CD11b et CD45, on peut distinguer entre les cellules myéloïdes et résident infiltrées dans le tissu ischémique. Cette population CD11b + augmente dans l&#39;hémisphère ischémique par rapport à la naïve et avec le groupe témoin, dans lequel ces cellules sont souvent associées à une faible expression de CD45 indiquant que la microglie prolifère après l&#39;ischémie (Figure 4, Figure 5 et le Tableau 5) . Cette différence est probablement due à l&#39;infiltration de cellules à partir de la périphérie, comme le montre l&#39;apparition d&#39;une sous-population de cellules CD45 + CD11b salut dans le cerveau ischémique (Figure 4, La figure 5 et le tableau 5), qui est en faible nombre et dans les cerveaux naïf fictives. La contribution des infiltrats à la population de cellules CD11b + dans l&#39;ischémie cérébrale est un processus très dynamique 4. Dans le modèle MCAO par ligature, il peut varier de 30% à 60% des cellules CD11b + totaux en fonction de la taille de la lésion et du moment où la caractérisation a été effectuée. Les neutrophiles, caractérisé comme cellules Ly-6G + sont les plus nombreuses, la population de cellules infiltrées trouvé à 24 heures après la MCAO dans le cerveau de souris en utilisant ce modèle ischémique de l&#39;ischémie cérébrale, car ils comprennent le 70-80% de la CD11b + CD45 salut. Le reste des cellules sont surtout une sous-population de CD11b + CD45 Ly-6G hi - monocytes pro-inflammatoires hi Ly-6C. Dans ce modèle, cette population augmente en nombre dans les zones ischémiques du cerveau de 24 à 48 heures après la MCAO. Figure 1:. Procédure chirurgicale pour la ligature MCA (A) après la rétraction du muscle temporal, une petite craniotomie est effectuée dans le crâne de la souris. MCA est ligaturé par un nœud ou un nœud coulant en utilisant un fil de suture 9/0. (B) des images représentatives de la lésion corticale généré par le modèle MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Figure 2: Quantification du volume de l&#39;infarctus par Cavalieri. (A) des images représentatives de coupes de cerveau Nissl colorées 24 heures après la ligature MCA permanente. Le fort grossissement montre la zone hipocromatic après coloration de Nissl quiidentifie la zone endommagée (de base) après MCAO. La région Peri-infarctus (PI) est également indiquée. (B) Quantification du volume de l&#39;infarctus représenté en% infarci hémisphère (% IH) en utilisant la méthode Cavalieri dans les sections de série Nissl colorées, 24 heures après la MCAO (n = 50 souris ). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Figure 3: stéréologique quantification des neutrophiles dans la zone infarcie 24 et 48 heures après la ligature, en utilisant la méthode de fractionnement optique. (A) Représentant l&#39;image de neutrophiles (cellules infiltrées Ly6G-positifs) dans la zone ischémique à 24 heures après la MCAO. Délimitation montre la zone infarcie. (B, C) ​​Des exemples d&#39;un dissecteur optique pour la quantification des neutrophiles par la colonne de fractionnement optique (D). La quantification de neutrophiles totaux dans la région infarcie à 24 et 48 h (n = 4 souris). (E)Corrélation entre le nombre de neutrophiles avec la taille de l&#39;infarctus à 24 et 48 heures après la ligature MCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Figure 4:. Représentant analyse dot-diagramme de dispersion des leucocytes du cerveau obtenue à partir hémisphères naïve, imposture et ischémique (24 h après MCAO) sur la base de paramètres physiques (SSC et FSC) Une population d&#39;événements qui expriment CD11b (rouge) a été identifié dans tous les groupes. Cette population a été fermé et caractérisé, selon l&#39;expression de CD45. Les cellules exprimant des niveaux faibles de CD45 (vert) étaient présents dans le cortex cérébral ischémique et non ischémique et correspondent à des cellules microgliales. En revanche, les cellules exprimant des niveaux élevés de CD45 (jaune) ne étaienttrouvé dans l&#39;hémisphère ischémique et dans une moindre mesure dans le groupe imposture. Une analyse plus approfondie de la population salut CD11b + CD45 indique que les neutrophiles (Ly-6G + cellules, bleu) et pro-inflammatoires monocytes (cellules Ly-6C Bonjour, orange) sont les principaux sous-populations de cellules trouvées dans le cerveau infiltre 24 heures après un AVC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Figure 5:. Gating stratégies pour différencier résident de cellules myéloïdes infiltrées dans le tissu ischémique CD11b + ont été première cellule gated fonction de l&#39;intensité de fluorescence d&#39;isotype (A). Un tracé de points représentant de suspensions cellulaires du cerveau ischémique est affiché dans le coin en haut à droite du panneau. EnDe plus, des valeurs typiques pour le nombre total d&#39;événements et pour le nombre de CD11b + événements acquis en utilisant cette technique est indiqué (pas de cellules / ischémique hémisphère du cerveau;. (A) CD45 fluorescence analyse de l&#39;intensité des CD11b cellules + figure dans le panneau B. Une analyse de tracé de points représentant du CD45 et CD11b expression de la sous-population CD11b + fermée est affiché dans le coin en haut à droite du panneau. En outre, le nombre typique de CD45 lo CD45 cellules salut acquis par ischémique hémisphère du cerveau en utilisant cette technique est montré (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Les paramètres utilisés pour la méthode Cavalieri </td></tr><tr><td> Section épaisseur (t) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Objectif </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Fraction d&#39;échantillonnage Slice (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Distance entre les sections </td><td> 600 um </td></tr><tr><td> Grille Espacement </td><td> 100 um </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Paramètres utilisés pour la quantification stéréologique du tissu infarci. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Résultats </td><td> Contralésionnelle </td><td> Ipsilésionnelle </td><td> Infarctus </td></tr><tr><td> Zone (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> Volume (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Le volume corrigé pour Au cours de projection (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Coefficient de Erreur (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coefficient de Erreur (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coefficient de Erreur (Gundersen), alpha (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Infarci hémisphère </td><td colspan="2"> 14,90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Œdème cérébral (Ips Vol / Vol Cont) </td><td colspan="2"> 1,02 </td></tr></tbody></table> Tableau 2: exemples représentatifs de volumes contralésionnel, ipsilésionnelle et infarctus par la méthode Cavalieri en utilisant le logiciel de chercheur stéréo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan style = &quot;2&quot;&gt; paramètres utilisés pour la colonne de fractionnement optique </td></tr><tr><td> Section Epaisseur (TSF) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Objectif </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Fraction d&#39;échantillonnage Slice (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Compter Cadre Hauteur </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Compter Largeur du cadre </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> X taille de grille </td><td> 230 um </td></tr><tr><td> X taille de grille </td><td> 230 um </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 pm </td></tr><tr><td> Optique disector Hauteur </td><td> 14 pm </td></tr></tbody></table> Tableau 3: Les paramètres utilisés pour la quantification stéréologique de neutrophiles infiltrés après ischémie cérébrale avec la sonde de fractionnement optique en utilisant le logiciel de chercheur stéréo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Estimation des neutrophiles par le fractionneur optique </td></tr><tr><td> Nombre de sites d&#39;échantillonnage </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Facteur de forme </td><td> 6,24 </td></tr><tr><td> Total des marqueurs comptés </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Les neutrophiles estimés par fractionnement optique </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coefficient de Erreur (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> Coefficient de Erreur (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,09 </td></tr></tbody></table> Tableau 4: un exemple représentatif des neutrophiles infiltrés estimés après ischémie cérébrale avec la sonde de fractionnement optique en utilisant le logiciel de chercheur stéréo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Neutrophiles </td><td> Monocytes </td><td> Microglie </td></tr><tr><td> Naïf </td><td> 25 863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75,8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19 012 ± 1523 </td></tr><tr><td> Sham 24 h </td><td> 24 563 ± 5263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1124 ± 391,5 </td><td> 23 734 ± 2910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 h </td><td> 47 922 ± 23 174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4826 ± 1345 </td><td> 35 395 ± 10 833 </td></tr></tbody></table> Tableau 5: Résultats représentatifs des cellules myéloïdes estimés après ischémie cérébrale avec l&#39;approche de cytométrie en flux.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Cerveau cellules myéloïdes caractérisation suivante course peut être réalisée par stéréologie selon la méthode de fractionnement optique, ou par une analyse de cytométrie en flux de cerveau leucocytes suspensions. Les deux sont des techniques utiles pour effectuer une distinction phénotypique précise des principaux sous-ensembles de cellules myéloïdes dans le cerveau ischémique.

Stéréologique et cytométrie de flux Caractérisation des sous-populations leucocytaires dans les modèles de transitoires ou permanentes ischémie cérébrale

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