Name: stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li><li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods:+the+optical+disector+and+fractionator.">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li><li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans.">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke;+a.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li><li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain.">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li><li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells.">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).</li><li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung:+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area.">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li><li>Hern&#225;ndez-Jim&#233;nez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage.">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li><li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis.">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Y&#233;benes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+overload,+measured+as+serum+ferritin,+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion.">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li><li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent,+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke.">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPAR&#947;+Agonist+Rosiglitazone.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPAR&#947; Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression.">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מודל איסכמיה המוחי הציג כאן נותן כרכי אוטם מאוד לשחזור נקבעו 24-48 שעות ו -7 ימים לאחר MCA קשירה ידי גישות שונות 8,15,17. יש מודל MCAO זה שיעור נמוך תמותה (פחות מ -1%) בהשוואה לאחרים, צמצום מספר בעלי החיים המשמשים במחקרים. שלב קריטי כדי להשיג את השיעור הנמוך הזה של תמותה הוא לשמור על תנאים אספטיים נאותים כדי למנוע זיהומים שעלולים לפגוע בהישרדות לאחר אינדוקציה שבץ. מודל MCAO זה יכול לא רק לשמש כמודל MCAO קבע, שנחשב למודל רלוונטי קליני למחקר translational 18, אלא גם כמודל חולף ידי קשירה זמנית של המרכז לאמנות העכשווית וMCA עם Slipknot וreperfusion האחורי בזמן הרצוי 19. שיטה זו שמשה בהצלחה בעכברים וחולדות 17,20. כל ראיות מצביעות על כך שזה MCAO על ידי קשירה הוא מודל רב-תכליתי גבוה של איסכמיה המוחית עם יישומים מרובים. Critiצעד cal של טכניקה זו הוא שהיא דורשת ניתוח פולשני תחת סטראו; craniotomy צריכה להתבצע בזהירות רבה כדי לא לפגוע בעצם הלחי, כמו גם את MCA. עם זאת, השימוש בבעלי חי דמה (אשר נתון להליך כירורגי אבל קשירת CCA וMCA לא מתבצע) מספק כלי שימושי להפלות השפעות הליך תלוי כירורגית. הבאות בטכניקה זו המידה של פגיעה מוחית ניתן לכמת על ידי מספר שיטות. הפרוטוקול של חתך מוח, מכתים Nissl וההערכה הבאה של אמצעי האחסון על ידי Cavalieri שלנו מאפשר לכימות מדויק של האזור הפגוע וממזער את מספר העכברים המשמשים בסוג זה של מחקרים מאז חלקים במוח הסידורי יכולים לשמש גם לניתוח immunohistochemical שונה. לביצועים טובים יותר של מתודולוגיה זו, זה קריטי לבחור את הפרמטרים המתאימים בשימוש בתוכנת stereology (טבלה 1) שיהיה צורך להערכת הדואר נפח של האזורים השונים על ידי הנוסחא: V = 1 / SSF * * f * t ΣP i (SSF הוא שבר דגימת פרוסה, t הוא העובי הממוצע של הסעיפים, f היא האזור של ריווח הרשת ו ΣP את מספר הנקודות שפגע במבנה). MCAO דיסטלי על ידי קשירה יכול להיות שימושי כדי לאפיין את ויקוציטים הסתננו ותת-אוכלוסיות של תאים חיסוניים 8,13 המשתתפים בתהליך הדלקתי בעקבות פציעת מוח 1-4. כאן, אנו מציעים שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוניים במוח, גישת stereological מדויקת וניתוח הזרימה cytometric לטוב האפיון תת-אוכלוסיות leukocytes מרובה. מנצלת את חתך מוח סדרתי, כימות של המספר הכולל של נויטרופילים יכולה להיות מושגת על ידי השיטה האופטית fractionator 16, האומדת את המספר הכולל של תאים ממספר התאים שנדגמו שנינותחה סט שיטתי נדגמים מקריים (SRS) של חללים משוחדות וירטואליים ספירה מכסים את האזור כולו של עניין, במקרה שלנו באזור האוטם, עם מרחק אחיד בין חללי ספירה וירטואליים משוחדות בX כיוונים, Y ו- Z. שיטה זו מספק כלי מדויק ל להעריך מספרי נויטרופילים הכולל במוח איסכמי בזמנים שונים לאחר קשירה. למרות שזה לא הוכח במחקר זה, פרוטוקול זה יכול לשמש גם להערכה של תת-האוכלוסיות השונות נויטרופילים לאחר איסכמיה 21 ולכימות מדויק של כל אוכלוסיית תאים אחרת הנמצאת במוח איסכמי כמו כדוריות דם לבנות הסתננו אחרים (מונוציטים / מקרופאגים) וגם להערכת הנוירונים ששרדו או אפילו לכימות neurogenesis לאחר שבץ. הצעד החשוב ביותר להערכה מדויקת באזור הרצוי הוא הבחירה של הפרמטרים המתאימים, כמו אלה שמוצגים בטבלה 3 לכימות נויטרופילים באזור איסכמי.פרמטרים אלה ישמשו לתוכנת stereology כדי לחשב את מספר התאים החיוביים הכולל (N) על ידי שימוש במשוואה N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- הוא המספר הכולל של תאים נספרו ב fractionator, SSF הוא שבר דגימת הסעיף, ASF הוא אזור שבר הדגימה, וTSF הוא עובי בר דגימה) 5. למרות שמתודולוגיה זו היא איטית יותר מאשר טכניקות כימות אחרות (לדוגמא, ניתוח של סמני נויטרופילים ידי מ&quot;ג של רקמה, צפיפות של תמונות או מספר הנויטרופילים לכל שדה נציג), יש לו את היתרון להיות משוחד וטכניקה מוצקה המספקת מדויק כימות של מספרים סלולריים. גישת בידוד ויקוציטים המוח מאפשרת זיהוי בו זמני וכימות של כמה תת תא חיסון ללא הצורך בהטית המערכת על ידי צביעת in vivo או מניפולציות גנטיות. תא לאחר מיון מp מיאלואידית המאופייןopulations או הפרדת immunomagnetic יכול לשמש ליישומים במורד הזרם מרובים, כגון מחקרים נוספים על גן או ביטוי חלבון. האפיון מדויק של נויטרופילים, מונוציטים ומיקרוגליה מתקבלים בשיטה זו מספק סגוליות גבוהה ביחס לשיטות קיימות, כגון מחקרי immunohistochemical, יתרון המאפשר הקצאת פונקציות ספציפיות לתאי מיאלואידית השונים אשר מתווכים תגובה חיסונית מולדת במוח. בנוסף, ניתן להאריך עוד יותר לאפיין אוכלוסיות אחרות במוח עם התווית המתאימה, כמו מקרופאגים דם נולד (CD11b + היי CD45 CD68 +), וזה יכול להיות מיושם לחקר פתולוגיות אחרות במערכת העצבים המרכזית או פציעות. לכן טכניקה זו מספקת כלי חיוני כדי לחקור את ההטרוגניות של התגובה הדלקתית במוח. מגבלה העיקרית של טכניקה זו מתגוררת בהכנת השעיות ויקוציטים מרקמת המוח טרי, אשר יכולה לשנות אתמצב הפעלה של התאים או שינוי אנטיגן. למרות שטכניקה זו מאפשרת אפיון איכותי יותר מפורט בהשוואה למחקרי immunohistochemical, היא מספקת כימות פחות מדויק המבוסס על בידוד תא. למרות זאת, את היעילות של פרוטוקול בידוד תא שלנו היא דומה לשיטות אחרות שפורסמו 9 וניתן להשתמש בו ביעילות כדי לזהות הבדלים במספר התאים חיסוניים במוח בין שליטה וקבוצות MCAO או אפילו בין קבוצות MCAO נתון לטיפולים שונים 8. שלבים קריטיים של פרוטוקול זה הם לנתיחה הרקמה, הליך שיבוש רקמות, והסרת המיאלין. בנוגע לאיסוף הרקמות, ניתן לכלול צעד נורמליזציה (בהתחשב ברקמה שנאספו), כדי למנוע השתנות בשל הופעות נתיחה שונות. בנוסף, נורמליזציה בין קבוצות MCAO השונות יכולה להתרחש גם דרך נפח אוטם (שנקבע בעבר על ידי R המגנטיesonance). דרך נוספת לפתור את הבעיה הזו היא להשתמש בכל חצי הכדור ipsilateral של שני קבוצות איסכמי ושליטה, או אפילו להשתמש באונה הנגדית של עכבר איסכמי כביקורת כדי למזער את מספר בעלי החיים המשמשים. בעוד גישה זו נמנעת הבדלים בין כל נתיחה, יש לו חסרון עיקרי; גורם לדילול נוסף על ידי הגדלת המספר הכולל של תאים אך לא את מספר תאי מיאלואידית אשר ממוקמים באופן בלעדי בתחומי הליבה ופרי אוטם של קליפת המוח ipsilateral. לגבי שיבוש רקמות, פרוטוקול זה מדגים את השלבים להפרעה המכנית של תאי מוח, הימנעות טיפולים האנזימטית ומניעת שינוי פני השטח אנטיגן 9,22, נושא חיוני לניתוח איכותי וכמותית נוסף של תת-האוכלוסיות של תאים דלקתיים. בנוסף להכנת ההשעיה התא של עניין, הסרת המיאלין מדגימות המוח הוא צעד מומלץ מאוד להימנע מהפרעה לdownstיישומים לקדד, כגון הפרדת תאי immunomagnetic או cytometry זרימת 23,24. זה יכול להיות מושלם תוך שימוש בשיטות שונות, כגון סוכרוז או הדרגתיים Percoll, או חרוזים נגד המיאלין. כאן, ועל סמך מחקרים קודמים שהשוו שיטות שונות לבידוד השעיה תא המוח, הפרעה מכאנית בשילוב עם שימוש Percoll להסיר המיאלין משמש לשיפור תשואות תא ואת כדאיות 25.

שינויים מורפולוגיים, פנוטיפי וביטוי גנים של מיקרוגליה, כמו גם extravasation והפעלה של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous הם האמינו לשחק תפקיד מרכזי במפל pathophysiological בעקבות פציעת מוח 1-4. פרוטוקול זה מספק שתי גישות כדי להעריך את המספר של תת תא מיאלואידית שונה של מוח איסכמי ולבצע אפיון phenotypical. בנוסף, הוא גם מספק תיאור של מודל ניסיוני של איסכמיה המוחית בעכברים, אשר מורכב של קשירה החולפת או קבועה של שני עורק המוח התיכון דיסטלי (MCA) ועורק התרדמה המשותפת (CCA), כולל כיצד להעריך את האוטם בשיטה מדויקת Cavalieri באמצעות תוכנת stereological. הגישה הראשונה לאפיין תת תא מיאלואידית של מוח איסכמי היא שיטה stereological מבוססת על גישת fractionator האופטית 5. זהו ביותרנפוץ בדיקה stereological בתחום מדעי חיים ומספק רמה גבוהה של דיוק עם מקדמים נמוכים של שגיאת 5-7. זה הוא הבחירה הטובה ביותר לכימות תא כאשר הרקמה היא לחתוך למקטעים, כפי שהוא ימנע את ההטיה בהערכת תא בגלל הפיצול של הרקמה למקטעים. שיטה זו היא דרך חזקה מאוד לאפיין מספרים, דינמיקה ושינויים פנוטיפי של תת-אוכלוסיות נויטרופילים הסתננו של הרקמה איסכמית 8. גישת האפיון השנייה מבוססת על פרוטוקול שונה מקמפנלה ומשתפי פעולה 9 שמספק דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים מוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה. בניגוד לשיטות immunohistochemical קונבנציונליים, cytometry זרימת אפיון מאפשר הבחנה בין microglia (CD45 lo CD11b +) והסתננתי תאי מיאלואידית (CD45 היי CD11b +) המבוסס על ההבדל שלהםרמות ביטוי erent של CD45 9-13. בנוסף, מונוציטים פרו-דלקתיים (היי CD11b + Ly-6G CD45 - היי Ly-6C), נויטרופילים (היי CD11b + Ly-6G + CD45) ניתן להבחין ותת leukocytes אחרות של הרקמה איסכמית. גישה זו מספקת assay אמין והמהיר כדי להעריך neuroinflammation במודלים ניסיוניים של איסכמיה. עם זאת, עיבוד רקמות יכול להשפיע על מצב ההפעלה ומספרים של אוכלוסיות תאים השונות הנמצאות ברקמה איסכמית מתן אפיון חצי כמותית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

הפעלת מיקרוגליה, כמו גם extravasation של מקרופאגים ונויטרופילים haematogenous, הוא האמין לשחק תפקיד מרכזי בפגיעה מוחית לאחר שבץ. תת-אוכלוסיות תא מיאלואידית אלה יכולים להציג פנוטיפים ופונקציות שונים וצריכים להיות מכובד ומאופיינות ללמוד תקנתם ותרומתם לנזק לרקמות. פרוטוקול זה מספק שתי שיטות שונות לאפיון תאים חיסוני במוח: גישת stereological מדויקת וניתוח התזרים cytometric. גישת stereological מבוססת על השיטה האופטית fractionator, המחשבת את המספר הכולל של תאים באזור של עניין (מוח infarcted) מוערכת על ידי דגימה מקרית שיטתית. גישת האפיון השנייה מספקת דרך פשוטה לבודד השעיות ויקוציטים המוח ולאפיין אותם על ידי cytometry זרימה, המאפשר לאפיון של מיקרוגליה, הסתנן מונוציטים ונויטרופילים של הרקמה איסכמית. בנוסף, הוא גם דetails מודל איסכמיה מוחית בעכברים שבאופן בלעדי משפיע קליפת מוח, יצירת אוטמי שחזור מאוד עם שיעור נמוך של תמותה, ואת ההליך לעיבוד היסטולוגית המוח לאפיין נפח אוטם בשיטת Cavalieri.

מודל איסכמיה המוחי המוצג כאן מייצר אוטמים ראו אך ורק בקליפה מבלי להשפיע על רקמת striatal מאז סניפי lenticulostriatal של MCA שלהשקות סטריאטום לא יחסמו (איור 1). על ידי צביעת Nissl, האזור הפגוע יכול להיות מזוהה כאזור hypochromic קליפת המוח (איור 2). מודל זה מאופיין במחזורי אוטם לשחזור מאוד ב 24 שעות לאחר MCAO (IH% 15.89 ± 0.28) מוערך על ידי שיטת Cavalieri בסעיפים מוכתמים-Nissl (איור 2). הערכה של נפח infarcted בשיטת Cavalieri היא גישה מדויקת עם שגיאה נמוכה שבאה לידי ביטוי במקדם של השגיאה (CE) של Gundersen בההמיספרות contralesional וipsilesional כמו גם באזור infarcted (הטבלה 2). נפגע נפח רקמה יכול לבוא לידי ביטוי במ&quot;מ 3, אלא גם כIH% באמצעות הנוסחא בסעיף 3.2.13. בנוסף, להערכתמהנפח הכולל של אזורי ipsilesional וcontralesional מאפשר לחישוב מדד בצקת לתקן את נפח infarcted ולהימנע מהערכת יתר של הרקמות הפגועות (טבלה 2). בהתחשב בעיבוד חתך הסידורי של רקמת המוח, זה יכול להיות מנוצל כדי לבצע הערכה מדויקת של המספר הכולל של תת-אוכלוסיות של תאים, כמו נויטרופילים הסתננו, באזור איסכמי, באמצעות גישת Fractionator האופטי (איור 3 ולוח 4) עם פרמטרים שמוצגים בטבלה 3. פרוטוקול זה אומד מספר כולל של נויטרופילים (תאי Ly6G-חיוביים) באזור infarcted של 23328 ± 3,623 ב 24 שעות ו± 82856 8143 בשעה 48 בעכברים לאחר pMCAO (איור 3D). בהסכם עם מחקרים קודמים, חדירת נויטרופילים מתואמת ישירות עם גודל האוטם (איור 3E). הערכה של tהוא מספר הנויטרופילים בשיטת Fractionator האופטי הוא גישה מדויקת עם שגיאה נמוכה שבאו לידי ביטוי בספירה של Gundersen (לוח 4). הבידוד לויקוציטים וזרימת cytometry פרוטוקול אפיון מאפשר בידוד של 47922 ± 23174 תאי מיאלואידית מהקליפה של חצי הכדור ipsilesional של עכברי איסכמי. זה כולל 10-30% מהאירועים הכולל שנמצאו בהשעית התא. רובם המכריע של אירועים שנתפסו באמצעות פרוטוקול זה הווה פרמטר FSC נמוך, הקשורים לפסולת תאית (איור 4). הכתמת CD11b מראה כי התאים CD11b + ערך FSC גבוה יותר (איור 4), המצביעים על כך פסולת תא אינה מסומנת בסמן זה, וכפי שצוין בעבר, שזה יכול להיות מחוץ ניתוח נוסף על ידי קביעת סף FSC ב 200 9. הכמות המשתנה של פסולת תא שהושגה עם שיטה זו מצביעה על כך שהבדלים בתהליך הדגימהing (עיתוי, שימור רקמות, טמפרטורת מדגם, הסרת המיאלין יעילה, וכו &#39;) יכול להסביר את זה. בנוסף, השימוש במסננות תא נחוץ גם כדי למנוע את נוכחותו של מהדק סלולארי בדגימות; צעד זה צריך להיעשות לפני מכתים תא. שימוש באסטרטגית gating שמוצגת באיור 5 המבוסס על CD11b וביטוי CD45, אנו יכולים להבחין בין התושב ותאי מיאלואידית הסתננו ברקמה איסכמית. עליות אוכלוסיית CD11b + זה בחץ כדור איסכמי בהשוואה לנאיבית ועם קבוצת הדמה, שבו תאים אלה בעיקר קשורים לביטוי נמוך של CD45 המצביעים על כך מיקרוגליה הוא מתרבים לאחר איסכמיה (איור 4, איור 5 ולוח 5) . הבדל זה הוא כנראה עקב חדירת תא מהפריפריה, כפי שמעיד על ידי הופעתו של תת-אוכלוסייה של תאים היי CD11b + CD45 במוח איסכמי (איור 4<html> , איור 5 ולוח 5) שהוא מספר נמוך בנאיבי ובמוח של העמדת פנים. התרומה של מחלחל לאוכלוסיית תא CD11b + באיסכמיה היא תהליך דינמי מאוד 4. במודל MCAO על ידי קשירה, זה יכול להשתנות מ -30% ל -60% מCD11b + התאים הכולל תלוי בגודל של הנגע ושל הזמן שבו האפיון שנעשה. נויטרופילים, מאופיינים כתאי Ly-6G +, הם אוכלוסיית התא הסתנן הרבות ביותר נמצאת ב 24 שעות לאחר MCAO במוח עכבר איסכמי באמצעות מודל זה של איסכמיה המוחית, כפי שהם מהווים 70-80% מCD11b + CD45 היי. שאר התאים הם בעיקר תת-אוכלוסייה של CD11b + CD45 היי Ly-6G - מונוציטים Ly-6C היי פרו-דלקתיים. במודל זה, אוכלוסייה זו תגדל במספר באזורים במוח איסכמי 24-48 שעות לאחר MCAO. ithin-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig1.jpg" /> איור 1:. הליך כירורגי לקשירת MCA () לאחר הנסיגה של השרירים זמניים, פתיחת גולגולת קטנה מתבצעת בגולגולת העכבר. MCA גבעול על ידי קשר או Slipknot באמצעות תפר 9/0. (ב) נציג תמונות של הנגע בקליפת המוח שנוצר על ידי מודל MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> איור 2: כימות אוטם על ידי Cavalieri נפח. (א) נציג תמונות של חלקים במוח צבעוניים Nissl 24 שעות לאחר קשירת MCA קבועה. ההגדלה הגבוהה מציגה את אזור hipocromatic לאחר צביעת Nissl שמזהה את האזור הפגוע (ליבה) לאחר MCAO. פרי-אוטם האזור (PI) מוצג גם. (ב) כימות של האוטם מיוצג כ% Infarcted חצי הכדור (IH%) על ידי שימוש בשיטת Cavalieri בסעיפים מוכתמים-Nissl סדרתי, 24 שעות לאחר MCAO (n = 50 עכברי הנפח ). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> איור 3: כימות Stereological של נויטרופילים באזור infarcted 24 ו -48 שעות לאחר קשירה, תוך שימוש בשיטת Fractionator אופטית. תמונה () נציג של נויטרופילים הסתננו (תאי Ly6G-חיוביים) באזור איסכמי ב 24 שעות לאחר MCAO. תיחום מציג את אזור infarcted. (B, C) ​​דוגמאות למבתר אופטי לכימות נויטרופילים ידי fractionator האופטי. (ד) כימות של נויטרופילים הכולל באזור infarcted ב 24 ו- 48 שעות (n = 4 עכברים). (E)מתאם של מספר הנויטרופילים עם גודל האוטם ב 24 ו -48 שעות לאחר קשירת MCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> איור 4:. ניתוח פיזור dot-עלילת נציג של לויקוציטים המוח המתקבל מנאיבי, זיוף ואיסכמי (24 שעות לאחר MCAO) ההמיספרות על בסיס פרמטרים פיזיים (SSC וFSC) אוכלוסייה של אירועים המבטאות CD11b (אדום) זוהתה בכל הקבוצות. אוכלוסייה זו מגודרת ומאופיינת על פי הביטוי של CD45. תאים המבטאים רמות נמוכות של CD45 (ירוק) היו נוכחים בקליפת מוח איסכמי ולא-איסכמי ותואמים את תאי microglial. בניגוד לכך, תאים המבטאים רמות גבוהות של CD45 (צהובים) היו רקמצא בחצי כדור איסכמי ובקבוצת דמה מידה פחותה. ניתוח נוסף של האוכלוסייה היי CD11b + CD45 מצביע על כך שמונוציטים נויטרופילים (Ly-6G + תאים, כחולים) ופרו-דלקתיים (תאים היי Ly-6C, כתומים) הם תת-אוכלוסיות התאים העיקריות שנמצאו במוח מחלחל 24 שעות לאחר שבץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> איור 5:. Gating אסטרטגיות כדי לבדל את התושב מתאי מיאלואידית הסתננו ברקמה איסכמית תא CD11b + היה מגודר ראשון לפי עוצמת הקרינה אלוטיפ (). עלילת נקודת נציג של מתלי תא של מוח איסכמי מוצגת בפינה עד-ימנית של הלוח. בבנוסף, ערכים אופייניים למספר הכולל של אירועים ולמספר CD11b + האירועים שנרכשו באמצעות טכניקה זו מוצגים (לא של תאים / חצי הכדור המוח איסכמי;. (א) ניתוח עוצמת CD45 הקרינה של התאים + CD11b מוצג בלוח ב ניתוח עלילת נקודת נציג ביטוי CD45 וCD11b של תת-אוכלוסיית CD11b + מגודר מוצג בפינה עד-ימנית של הלוח. בנוסף, המספר האופייני לתאים היי CD45 lo CD45 רכשו לאונת מוח איסכמי באמצעות טכניקה זו מוצג (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> פרמטרים המשמשים לשיטת Cavalieri </td></tr><tr><td> עובי סעיף (t) </td><td> 30 מיקרומטר </td></tr><tr><td> מטרה </td><td> 10X </td></tr><tr><td> חלק Slice דגימה (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> מרחק בין חלקים </td><td> 600 מיקרומטר </td></tr><tr><td> מרווחי רשת </td><td> 100 מיקרומטר </td></tr></tbody></table> טבלה 1: פרמטרים המשמשים לכימות stereological של רקמת infarcted. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תוצאות </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> אוֹטֵם לֵב </td></tr><tr><td> אזור (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> נפח (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> נפח מתוקן ל במהלך הקרנה (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ = 0 </td><td> .068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ &#39;= 1 </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), אלפא (q) </td><td> .068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Infarcted חצי כדור </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> המוח יתכן בצקת (כרך שב&quot;ס כרך / המשך) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: דוגמאות מייצגות של כרכי contralesional, ipsilesional ואוטם בשיטת Cavalieri שימוש בתוכנת חוקר סטריאו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td col<html> = &quot;2&quot; פרמטרים&gt; משמשים לfractionator האופטי תוחלת </td></tr><tr><td> עובי סעיף (TSF) </td><td> 30 מיקרומטר </td></tr><tr><td> מטרה </td><td> 100X </td></tr><tr><td> חלק Slice דגימה (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> ספירת גובה מסגרת </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> ספירת רוחב מסגרת </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> גודל רשת X </td><td> 230 מיקרומטר </td></tr><tr><td> גודל רשת X </td><td> 230 מיקרומטר </td></tr><tr><td> משמר בטוח </td><td> 2 מיקרומטר </td></tr><tr><td> גובה Disector אופטי </td><td> 14 מיקרומטר </td></tr></tbody></table> טבלה 3: פרמטרים המשמשים לכימות stereological של נויטרופילים הסתננו לאחר איסכמיה עם חללית fractionator האופטית על ידי שימוש בתוכנת חוקר סטריאו. <table border="0" cellpadding="0" cellspa</html style=";text-align:right;direction:rtl">cing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> הערכה של נויטרופילים ידי Fractionator האופטי </td></tr><tr><td> מספר דגימת האתרים </td><td> 430 </td></tr><tr><td> לעצב את פקטור </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ סמני ספרה </td><td> 166 </td></tr><tr><td> נויטרופילים הוערכו על ידי Fractionator האופטי </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ &#39;= 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> מקדם של שגיאה (Gundersen), מ &#39;= 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> לוח 4: דוגמא נציג של אומדן נויטרופילים הסתננו לאחר איסכמיה עם חללית Fractionator אופטית על ידי שימוש בתוכנת חוקר סטריאו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> נויטרופילים </td><td> מונוציטים </td><td> Microglia </td></tr><tr><td> נאיבי </td><td> 25863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191.4 </td><td> 19012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> hr 24 Sham </td><td> 24563 ± 5263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1,124 ± 391.5 </td><td> 23734 ± 2,910 </td></tr><tr><td> hr pMCAO 24 </td><td> 47922 ± 23174 </td><td> 4874 ± 748.7 </td><td> 4826 ± 1,345 </td><td> 35395 ± 10833 </td></tr></tbody></table> לוח 5: תוצאות נציג של תאי מיאלואידית נאמדים לאחר איסכמיה עם זרימת גישת cytometry.

Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי.

Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

היישום של קשירת העורקים התיכון הקבע מוחין העכבר

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

חסימת כלי דם מוחי בלתי הפיך<em&gt; דרך</em&gt; Ligature וחיתוך רוחב זוגי

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

דוגמנות שבץ בעכברים: קרישה קבועה של עורקי דיסטלי התיכון מוחין

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

ההדמיה PET / MRI בו זמנית בעכבר מוחין היפוקסיה-איסכמיה

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

דגם שבץ טרומבוטיים בהתבסס על היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Performing מוחות תיכונים דיסטלי קבוע עם ספיגה עורקת Common הראש אצל חולדות בנים לחקר קורטיקלי איסכמיה עם נכות קבועה זה

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...