Name: stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
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This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에서 소개 뇌허혈 모델은 높은 재현성 경색 볼륨이 24 ~ 48 시간과 다른 접근 방법 8,15,17으로 MCA 결찰 후 7 일 결정 제공합니다. 이 MCAO 모델 연구에 사용 된 동물의 수를 최소화하는 다른 사람에 비해 낮은 사망률 (1 % 미만)을 갖는다. 사망률이 낮은 비율을 얻기 위해 중요한 단계 뇌졸중 유도 후 생존에 손상을 줄 수있는 감염을 방지하기 위해 적절한 무균 상태를 유지하는 것이다. 이 MCAO 모델은 또한 원하는 시간 매듭 후방 재관류 CCA 및 MCA 과도 결찰술 일시적인 모델로서, 병진 연구 18 임상 관련 모델 간주 영구 MCAO 모델로서 이용 될 수 없다 19. 이 방법은 성공적으로 마우스 및 래트 17,20 사용되어왔다. 이 모든 증거는 결찰에 의해 MCAO 여러 응용 프로그램과 뇌경색의 높은 다양한 모델을 나타냅니다. criti이 기술의 CAL 단계는 실체 현미경 침습 수술을 필요로한다는 것이다; MCA뿐만 아니라 광대뼈 손상되지로서 개두술은 매우 신중하게 수행되어야한다. 그러나 가짜 동물의 사용 수술에 의존하는 효과를 구별 할 수있는 유용한 도구가 제공 (수술하지만 CCA와 MCA 결찰을 실시한다 수행되지 않습니다). 이 기술에 따라 뇌 손상의 정도는 다양한 방법에 의해 정량화 될 수있다. 뇌 절편, Nissl 염색 및 카발리 의한 체적의 후속 추정 우리 프로토콜은 손상된 영역의 정확한 정량 분석​​이 가능하며 직렬 뇌 섹션이 또한 서로 다른 면역 분석에 이용 될 수 있기 때문에, 연구의 이러한 유형에서 사용 된 마우스의 수를 최소화한다. 이 방법론의보다 나은 성능이 Stereology를 소프트웨어에 사용 된 적절한 파라미터를 선택하는 것이 중요하다 (표 1) 번째를 추정 할 필요식 상이한 영역의 전자 량 : V = 1 / SSF는 * f를 * t의 *의 ΣP 난 (SSF는 t가 섹션의 평균 두께, 슬라이스 샘플링 분획이고, f는 그리드 간격의 면적이며 ΣP 구조 타격 포인트의 수). 결찰술 원위 MCAO은 백혈구 침윤 및 면역 세포 아 집단 뇌 손상 1-4 다음 염증 과정에 참여하는 8, 13를 특성화하는 것이 유용 할 수있다. 여기서는 뇌 면역 세포 특성화, 정확한 접근법 stereological 나은 여러 백혈구의 아 집단을 특성화 유세포 분석을위한 두 가지 방법을 제안한다. 직렬 뇌 절편을 살려, 호중구의 총수의 정량화 세포 샘플 재치 수의 세포의 총 수를 추정 광학 분별 법 (16)에 의해 달성 될 수있다하 방향 X에 편견 가상 계산 공간 사이의 균일 한 거리와 우리의 경우, 경색 영역을 관심의 전체 영역을 커버 편견 가상 계산 공간의 체계적인 무작위 샘플링 (SRS) 세트, Y 및 Z를이 방법에 대한 정확한 도구를 제공합니다 결찰 후 서로 다른 시간에 허혈성 뇌에 총 호중구 수를 추정한다. 이 본 연구에 도시되지 않았지만,이 프로토콜은 또한 허혈 21 후에 다른 침윤 백혈구 등의 허혈성 뇌에서 발견 된 임의의 다른 세포 집단의 정확한 정량 다른 호중구 개체군의 추정을 위해 사용될 수있다 (단핵구 / 대 식세포) 또한 생존 신경을 추정 또는 뇌졸중 후 신경의 정량. 것들 허혈 영역에서 호중구 부량 표 3에 나타낸 바와 같이, 원하는 영역의 정확한 추정을위한 가장 중요한 단계는, 해당 변수의 선택이다.이러한 매개 변수는 (ΣQ- 함께 카운트 세포의 총 수이고 N = ΣQ- X 1 / SSF X 1 / ASF X 1 / TSF를 수학 식을 이용하여 전체 포지티브 세포 수 (N)를 계산하는 Stereology를 소프트웨어에 사용될 분별, SSF는 ASF 샘플링 면적 분율이고, TSF는 샘플링 분획 두께) (5)이고, 부 샘플링 비율이다. 이 방법론은 다른 정량화 기법보다 느리지 만 (예를 들어, 조직, 대표적인 이미지 또는 필드 당 호중구 수의 밀도 측정의 MG 의한 호중구 마커의 분석), 그것은 공평하고 정확한 제공 고체 기법이 될 수있는 장점을 갖는다 세포 수의 정량. 뇌 백혈구 분리 방식은 바이어스 할 필요 생체 염색 또는 유전자 조작에 의해 시스템이없는 동시 식별 및 여러 면역 세포 아형의 정량화 수 있습니다. 특징 골수 페이지에서 정렬 이후 세포opulations 또는 면역 자기 분리가 이러한 유전자 또는 단백질 발현에 대한 추가 연구 하류 여러 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 방법으로 얻은 호중구, 단핵구 및 미세 아교 세포의 정확한 특성은 면역 조직 화학적 연구, 뇌의 선천성 면역 반응을 매개하는 다른 골수 세포에 특정 기능을 할당 할 수있는 장점으로 기존의 방법에 대해 높은 특이성을 제공합니다. 또한, 추가로 혈액 태어난 식세포 (는 CD11b + CD45 하이 CD68 +)와 같이, 적절한 라벨 다른 뇌 개체군을 특성화하도록 확장 될 수 있으며 다른 CNS 병리 또는 부상의 연구에 적용 할 수있다. 따라서이 기술은 뇌의 염증 반응의 이질성을 탐구하는 필수적인 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 제한을 변경할 수있는 새로운 뇌 조직으로부터 백혈구 현탁액의 제조에 상주세포 또는 항원 변경의 활성화 상태. 이 기술은 면역 조직 화학 연구에 비해보다 상세한 정 성적 특성 분석을 할 수 있지만, 그것은 세포의 분리에 기초하여 덜 정확한 정량화를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 우리 세포 격리 프로토콜의 효율은 다른 출판 방법론 9 유사하고이를 효율적으로 제어하고 MCAO 그룹 사이 또는 심지어 다른 처리 8 실시 MCAO 그룹 사이의 뇌 면역 세포의 수의 차이를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 해부 조직, 조직 파괴 절차 및 미엘린 제거한다. 조직 수집에 대해서, 정규화 단계 인해 상이한 박리 성능에 변동을 피하기 위해 (수집 된 조직을 칭량) &#39;도 포함될 수있다. 또한, 다른 그룹 사이 MCAO 정규화는 경색 량 통해 발생할 수 (미리 자기 R에 의해 결정esonance). 이 문제를 해결하는 또 다른 방법은 허혈성과 대조군의 전체 동측 반구를 사용하거나, 심지어 사용 된 동물의 수를 최소화하는 대조군으로서 마우스의 허혈성 반구 반대측을 사용하는 것이다. 이 방법은 각 절개 차이점을 회피 동안, 주요 단점이있다; 희석 배수는 독점적 동측 피질의 코어 및 경색 주변 영역에있는 골수 세포의 수를 셀의 총 개수를 증가 아니지만 의해 부가된다. 조직 파괴에 대해서는,이 프로토콜은 뇌 세포의 기계적 파쇄 단계 효소 처리를 방지하고 표면 항원 변조 9,22, 염증 세포 개체군의 추가적인 정성 및 정량 분석을위한 필수적인 문제를 방지를 나타낸다. 관심의 세포 현탁액의 제조뿐만 아니라, 뇌 샘플로부터 미엘린 제거 downst와의 간섭을 피하기 위해 추천 단계는이러한 면역 자기 세포 분리 또는 세포 계측법 (23, 24) 흐름으로 연 응용 프로그램. 이것은 여러 가지 방법, 예컨대 수크로오스 또는 퍼콜 구배, 또는 항 미엘린 비드를 사용하여 달성 될 수있다. 여기, 세포 수율을 개선하는 데 사용됩니다 수초를 제거하는 퍼콜 사용과 함께 뇌 세포 현탁액 분리, 기계적 중단을위한 다른 방법을 비교하고 25 생존 이전의 연구를 기반으로.

형태 학적 표현형 및 미세 아교 세포 유전자 발현의 변화뿐만 아니라, 혈관 외 유출 및 haematogenous 식세포의 활성화 및 호중구가 뇌 손상 1-4 다음 병리 생리 캐스케이드에서 핵심적인 역할을 수행 할 것으로 생각된다. 이 프로토콜은 두 가지 방식 허혈성 뇌 골수 세포의 다른 서브 세트들의 수를 추정하고 자신의 표현형을 특성화를 수행하기 위해 제공한다. 또한, 또한, 방법 경색을 평가 포함 원위부 중뇌 동맥 일시적 또는 영구적 결찰 (MCA) 및 총 경동맥 (CCA)로 구성되어 마우스에서 대뇌 허혈 실험 모델의 설명을 제공한다 stereological 소프트웨어를 사용하여 정확한 카발리 법에 의해. 허혈성 뇌의 골수 세포의 서브 세트를 결정하기에 첫 번째 방법은 광학 분별 접근법에 기초하여 5 stereological 방법이다. 이것은 대부분이며일반적으로 생명 과학 분야 stereological 프로브를 사용하고 오류 5-7의 낮은 계수와 높은 정확도를 제공한다. 이 때문에 섹션으로 조직의 분열의 세포 추정에 대한 편견을 피할 수로 조직이, 섹션으로 잘라 때이 세포 정량을위한 최고의 선택입니다. 이 방법은 숫자, 역학과 허혈성 조직 (8)의 침투 호중구 개체군의 표현형 변화를 특징 짓는 매우 강력한 방법입니다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 백혈구 현탁액을 분리 및 유동 세포 계측법에 의해이를 특성화하는 간단한 방법을 제공 캄파넬라 협력자 (9)로부터 개질 된 프로토콜에 기초한다. 종래의 면역 조직 화학 기법과 대조적으로, DIFF에 기초하여 자신의 골수 세포 (CD45 하이는 CD11b +)을 특성화 (LO는 CD11b + CD45) 미세 아교 세포를 구별 허용 유동 세포 계측법 및 침투CD45 9-13의 erent 발현 수준. 또한, 염증성 단구 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G - LY-6C 안녕은), 호중구는 (CD45 안녕으로 CD11b + LY-6G +) 및 허혈성 조직의 다른 백혈구 부분 집합 구별 할 수있다. 이 접근법은 뇌 허혈 실험 모델에서 신경 염증을 평가하는 신뢰성 있고 신속한 분석을 제공한다. 그러나, 조직 처리가 활성화 상태와 반 정량적 특성을 제공 허혈성 조직에서 발견되는 다양한 세포 집단의 수에 영향을 미칠 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라 haematogenous 식세포와 호중구의 혈관 외 유출은 뇌졸중 후 뇌 손상에서 중추적 역할을하는 것으로 생각된다. 이 골수 세포 개체군은 서로 다른 표현형 및 기능을 표시하고 구별 할 필요가 있고 조직 손상에 대한 그들의 규제와 공헌을 연구하는 특징으로 할 수 있습니다. 정확한 stereological 방법 및 유세포 분석 :이 프로토콜은 뇌 면역 세포의 특성화를 위해 두 가지 방법을 제공합니다. stereological 체계적인 접근법은 랜덤 샘플링에 의해 추정이자 (뇌 경색)의 영역에서 세포의 총 수를 계산 광학 분별 법에 기초한다. 두 번째 접근법은 특성화 뇌 현탁액 백혈구를 분리 및 미세 아교 세포의 특성 분석을 허용 유세포들을 특성화하는 간단한 방법을 제공하고, 단핵구 및 호중구 허혈성 조직의 침투. 또한, 교리독점적 사망률의 낮은 속도 및 카발리 법으로 경색 량을 특성화 뇌 조직 학적 처리 절차 재현성 경색을 발생, 뇌 피질에 영향을 쥐 뇌허혈 모델 etails.

여기에 도시 뇌허혈 모델 선조체 관개 MCA의 lenticulostriatal 분기 (도 1)에 흡장되지 않으므로 선조체 조직에 영향을주지 않고 단독으로 본 피질 경색을 발생시킨다. Nissl 염색으로, 손상된 영역은 담색 피질 영역 (도 2)로 식별 할 수있다. 이 모델은 Nissl 염색 섹션에서 카발리 에리 방법에 의해 추정 MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) (그림 2) 후 24 시간에서 높은 재현성 경색 볼륨을 특징으로한다. 카발리 법에 의한 경색 부피의 추정 및 contralesional ipsilesional 반구 Gundersen 님의 에러 (CE)의 계수뿐만 아니라 경색 영역 (표 2)에서 반사되는 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 손상된 조직 부피는 3 mm에서뿐만 아니라 섹션 3.2.13에 수식을 이용한 %를 IH로 표현 될 수있다. 또한, 추정ipsilesional contralesional 영역과의 합계 용적의 경색 부피를 보정하고 손상된 조직 (표 2)의 과대 평가를 피하기 위해 부종 지수의 계산을 허용한다. 뇌 조직의 일련 단면 처리 감안 이것은 광학 분별 방법 (도 3 및 표 4)를 사용하여, 허혈 영역에 침투 호중구와 같은 세포의 아 집단의 총 수의 정확한 추정을 수행의 장점을 취할 수 표 3 매개 변수.이 프로토콜은 24 시간과 pMCAO (그림 3D) 후 마우스에서 82,856 ± 8,143 48 시간에 23,328 ± 3,623의 경색 지역에서 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 총 수를 추정하고있다. 이전의 연구와 일치, 호중구의 침윤 직접 경색 크기 (그림 3E)와 관련된다. t 추정광학 분별 법에 의해 호중구의 수는 그 Gundersen 님 (표 4)에 의해 반사되는 CE 낮은 에러와 함께 정확한 접근법이다. 백혈구 분리 및 특성화 프로토콜을 유동 세포 계측법은 허혈성 마우스의 ipsilesional 반구의 피질에서 47,922 ± 23,174 골수 세포의 분리를 할 수 있습니다. 이 세포 현탁액에있는 이벤트 총 10-30 %로 포함한다. 세포 파편 (그림 4)에 관련이 프로토콜에 존재하는 낮은 FSC 매개 변수를 사용하여 캡처 사건의 대부분. CD11b를 염색으로 CD11b + 세포는 이전에 표시된 바와 같이이 200 9에서 FSC 임계 값을 설정하여 상기 분석에서 제외 될 수 있음을, 세포 파편이 마커로 표지되지 않은 것을 시사하고, (도 4)보다 높은 FSC 값을 가지고 있음을 보여준다. 이 방법으로 얻은 세포 파편의 양에 따라 샘플 과정에 그 차이를 알 수ING (타이밍, 조직 보존, 시료 온도 효율적인 제거 미엘린 등) 그것을 차지하고있다. 또한, 셀 멤브레인의 사용은 시료에서 셀룰러 클램프의 존재를 피하기 위해 필요하다; 이 단계는 이전의 세포 얼룩을 수행해야합니다. CD11b를 발현하고 CD45에 기초도 5에 도시 게이팅 전략을 사용하여, 우리는 허혈성 조직에 침투 거주자 골수 세포를 구별 할 수있다. 허혈성 반구이는 CD11b + 인구 증가는 (도 4,도 5 및 표 5) 순으로 이들 세포의 대부분이 미세 아교 세포는 허혈 후 확산되어있는 것을 나타내는 CD45의 낮은 발현에 관련되는 가짜 그룹과 비교했을 때 . 허혈성 뇌는 CD11b + CD45 하이 셀 모집단의 출현에 의해 입증되는 바와 같이 이러한 차이 (인해 주변으로부터 세포 침윤에도 4 쉽다그림 5와 순진한와 가짜 뇌에서 적은 수이다 표 5). 뇌 허혈는 CD11b + 세포 침윤 인구의 기여는 매우 역동적 인 과정 4이다. 결찰에 의해 MCAO 모델에서, 30 % 내지 병변의 크기 및 특성이 행해졌 시간 따라 합계는 CD11b + 세포의 60 %로 변할 수있다. LY-6G + 세포로서 특성화 호중구, 그들이는 CD11b + CD45의 70-80 %가 포함 같이, 뇌허혈이 모델을 이용하여 허혈성 마우스 뇌 MCAO 이후 24 시간에서 발견되는 가장 많은 침윤 세포 집단이다 하이. LY-6C 하이 염증성 단핵 세포 - 세포의 나머지는 대부분으로 CD11b + CD45 하이 LY-6G의 하위 집단이다. 이 모델에서는, 본 인구 (24)로부터 48 시간 후 MCAO에 허혈성 뇌 영역의 수를 증가시키는 것이다. 그림 1 :. MCA의 결찰 수술 (A) 시간적인 근육의 수축 후에는, 작은 개두술은 마우스 두개골에서 수행된다. MCA는 매듭 또는 9/0 봉합사를 사용하여 매듭 결찰한다. (B) MCAO 모델에 의해 생성 된 대뇌 피질의 병변의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> 그림 2 : 카발리 에리에 의해 경색 볼륨의 정량화. (A) Nissl 염색 뇌 섹션의 대표 이미지 영구 MCA 결찰 후 24 시간. 높은 배율 Nissl 염색 후 hipocromatic 영역을 보여주는MCAO 후 손상된 영역 (코어)를 식별합니다. 경색 주변 (PI) 영역이 또한 도시되어있다. (B) (N = MCAO 이후, 일련 Nissl 염색 섹션 50 쥐를 24 시간을 카발리 방법을 사용하여 % 경색 반구 (%의 IH)로 표현 경색 량 정량 ). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> 그림 3 : 경색 영역 (24)에서 호중구 및 결찰 후 48 시간의 Stereological 정량화, 광학 분별 방법을 사용. MCAO 후 24 시간에서 허혈 영역에 침투 호중구 (Ly6G 양성 세포)의 (A) 대표 이미지입니다. 경계 획정은 경색 영역을 보여줍니다. (B, C) ​​광학 분별에 의한 호중구 정량 광 해부학자의 예. (D) (24)의 경색 지역에서 총 호중구의 정량화 및 48 시간 (N = 4 마우스). (E)경색 (24)의 크기와 MCA 결찰 후 48 시간과 호중구의 수의 상관 관계. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> 그림 4 :. 물리적 매개 변수 (SSC와 FSC)에 기초 순진, 가짜 허혈성 (MCAO 후 24 시간) 반구에서 얻은 뇌 백혈구의 대표 도트 플롯 분산 분석으로 CD11b (빨간색)을 표현하는 이벤트의 인구는 확인되었다 모든 그룹에서. 이 인구는 CD45의 발현에 따라 게이트 및 특징이었다. CD45 (녹색) 낮은 수준을 발현하는 세포는 허혈 및 비 허혈성 뇌 피질의 존재 및 소교 세포에 맞습니다. 대조적으로, 세포 (노란색) 높은 수준의 CD45를 발현 만했다허혈성 반구와 가짜 그룹의 낮은 정도에서 발견. 는 CD11b + CD45 안녕하세요 인구의 추가 분석 호중구 (LY-6G + 세포, 파랑)과 염증성 단핵구 (LY-6C 안녕 세포, 오렌지)가 주요 세포 뇌에서 발견 소집단 뇌졸중 후 24 시간을 침투 있음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">제발 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> 도 5 :. 허혈성 조직에 침투 된 골수 세포로부터 상주 차별화 전략 게이팅는 CD11b + 세포는 먼저 이소 타입 형광 강도 (A)에 따른 게이트 하였다. 허혈성 뇌의 세포 현탁액의 대표 도트 플롯은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 에또한,이 기술을 이용하여 취득한 이벤트들의 총 수 및 CD11b를 + 이벤트 수에 대한 일반적인 값은 (도시 아니 셀 / 허혈성 뇌 반구]. (A)는 CD11b + 세포의 CD45 형광 강도 분석을 패널에 나타낸다 게이트는 CD11b + 아군의 CD45와 CD11b를 표현의 B. 대표 도트 플롯 분석은 패널의 위쪽 오른쪽 모서리에 표시됩니다. 또한, 허혈성 뇌 반구 당 획득 CD45 보라 CD45 안녕 세포의 전형적인 수가이 기술을 사용하여 (B)에 도시되어있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> 카발리 에리 방법에 사용되는 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (t) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 10X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> (1)/ 20 </td></tr><tr><td> 섹션 사이의 거리 </td><td> 600 μm의 </td></tr><tr><td> 그리드 간격 </td><td> 100 ㎛ </td></tr></tbody></table> 표 1 : 경색 조직의 stereological 정량에 사용되는 매개 변수. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 결과 </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> 경색 </td></tr><tr><td> 지역 (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> 볼륨 (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> 볼륨에 대한 수정 프로젝션 이상 (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;강한&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 0 </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) m = 1 </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님) 알파 (Q) </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % 경색 반구 </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> 뇌 Oedema (IPS 권 / 계속 권) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 스테레오 탐정 소프트웨어 사용 카발리 법에 의해, contralesional ipsilesional 경색 부피의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td col광학 분별 사용 범위 = &quot;2&quot;&gt; 매개 변수 </td></tr><tr><td> 섹션 두께 (TSF) </td><td> 30 μm의 </td></tr><tr><td> 목표 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 슬라이스 샘플링 비율 (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> 프레임 높이를 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> 프레임 폭을 계산 </td><td> 40 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> X 격자 크기 </td><td> 230 μm의 </td></tr><tr><td> 안전 가드 </td><td> 2 μm의 </td></tr><tr><td> 광학 Disector 높이 </td><td> 14 μm의 </td></tr></tbody></table> 표 3 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 프로브 분별 뇌허혈 후 호중구 침윤 stereological 정량화에 사용 파라미터. <table border="0" cellpadding="0" cellspa의 cing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> 광학 분별에 의한 호중구의 추정 </td></tr><tr><td> 샘플링 위치의 수 </td><td> (430) </td></tr><tr><td> 형상 인수 </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> 총 마커 카운트 </td><td> (166) </td></tr><tr><td> 광학 분별에 의해 추정 된 호중구 </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> 오류 계수 (Gundersen 님), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 스테레오 탐정 소프트웨어를 사용하여 광학 분별 프로브 뇌 허혈 후 예상 침투 호중구의 대표적인 예. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 는 CD11b + </td><td> 호중구 </td><td> 단핵구 </td><td> 미세 아교 세포 </td></tr><tr><td> 소박한 </td><td> 25,863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191.4 </td><td> 19,012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> 샴 24 시간 </td><td> 24,563 ± 5,263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1124 ± 391.5 </td><td> 23,734 ± 2,910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 시간 </td><td> 47,922 ± 23,174 </td><td> 4874 ± 748.7 </td><td> 4826 ± 1345 </td><td> 35,395 ± 10,833 </td></tr></tbody></table> 표 5 : 접근 유동 세포 계측법과 뇌 허혈 후 추정 된 골수 세포의 대표 결과.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

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