Name: stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
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This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

O modelo de isquemia cerebral introduzido aqui dá volumes de infarto altamente reprodutíveis determinada 24-48 horas e 7 dias após a ligadura MCA por diferentes abordagens 8,15,17. Este modelo MCAO tem uma baixa taxa de mortalidade (menos de 1%) em comparação com os outros, minimizando o número de animais utilizados nos estudos. Uma etapa fundamental para se obter esta baixa taxa de mortalidade é de manter as condições de assepsia adequadas para evitar infecções que poderiam prejudicar a sobrevivência após a indução acidente vascular cerebral. Este modelo MCAO pode não só ser usado como um modelo MCAO permanente, que é considerado um modelo clinicamente relevante para a investigação de translação 18, mas também como um modelo de transição por ligadura temporária da ACC e da MCA com um nó corrediço e posterior reperfusão no momento desejado 19. Este método tem sido utilizado com sucesso em ratinhos e ratos 17,20. Todas essas evidências indica que MCAO por ligação é um modelo versátil alta de isquemia cerebral com múltiplas aplicações. A critical passo desta técnica é que não requer cirurgia invasiva sob um estereomicroscópio; a craniotomia deve ser realizada com muito cuidado, para não danificar o osso zigomática bem como a MCA. No entanto, a utilização de animais sham (os quais são submetidos ao procedimento cirúrgico e da MCA mas CCA ligadura não é executada) proporciona uma ferramenta útil para discriminar efeitos dependentes de procedimentos cirúrgicos. A extensão da lesão cerebral após esta técnica pode ser quantificada por vários métodos. Nosso protocolo de seccionamento do cérebro, coloração de Nissl e subsequente estimativa do volume por Cavalieri permite uma quantificação exacta da região danificada e minimiza o número de ratos utilizados neste tipo de estudos desde secções de cérebro de série também pode ser utilizado para a análise imuno-histoquímica diferente. Para um melhor desempenho desta metodologia, é importante escolher os parâmetros apropriados utilizados no software estereologia (Tabela 1), que será necessária para a estimativa the volume das diferentes regiões pela fórmula: V = 1 / * ssf um f * t * i ΣP (SSF é a fracção de amostragem fatia, t é a espessura média das secções, uma f é a área do espaçamento da grelha e ΣP o número de pontos que afectam a estrutura). A MCAO distal por ligação pode ser útil para caracterizar o infiltrado de leucócitos e subpopulações de células imunes que 8,13 participar no processo inflamatório após lesão cerebral 1-4. Aqui, propomos duas metodologias diferentes para a caracterização do cérebro de células imunes, uma abordagem estereológica precisa e uma análise de citometria de fluxo para melhor caracterizar vários leucócitos as subpopulações. Tirando vantagem da série de corte cerebral, a quantificação do número total de neutrófilos pode ser conseguida pelo método de fraccionamento óptico 16, o qual calcula o número total de células a partir do número de células wit amostradoha aleatoriamente amostradas (SRS) conjunto sistemático de espaços virtuais imparciais contagem abrangendo toda a região de interesse, no nosso caso, a região de infarto, com distância uniforme entre os espaços virtuais de contagem imparciais em direções X, Y e Z. Este método fornece uma ferramenta precisa para estimar o número total de neutrófilos no cérebro isquémico em diferentes momentos após a ligação. Embora ainda não tenha sido demonstrado neste estudo, este protocolo pode também ser usado para a estimativa dos diferentes sub-populações de neutrófilos após isquemia e 21 para uma quantificação precisa de qualquer outra população de células encontradas no cérebro isquémico como outros leucócitos infiltrados (monócitos / macrófagos) e também para estimar neurônios sobreviventes ou mesmo para a neurogênese quantificação após acidente vascular cerebral. O passo mais importante para uma estimativa exacta da área desejada é a selecção dos parâmetros apropriados, como os mostrados na Tabela 3, para a quantificação de neutrófilos na região isquémica.Estes parâmetros serão usados ​​para o software de estereologia para calcular o número total de células positivas para (N), usando a equação N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / tsf (ΣQ- é o número total de células contadas com o de fraccionamento, SSF é a fração de amostragem seção, asf é a área fração de amostragem, e tsf é a espessura fração de amostragem) 5. Embora esta metodologia é mais lento do que outras técnicas de quantificação (por exemplo, análise de marcadores de neutrófilos por mg de tecido, densitometria de imagens ou o número de neutrófilos por campo representativo), que tem a vantagem de ser uma técnica imparcial e um sólido que proporciona uma precisão quantificação do número de células. A abordagem isolamento de leucócitos cérebro permite uma identificação e quantificação simultânea de vários subtipos de células imunológicas, sem a necessidade de influenciar o sistema por coloração in vivo ou manipulações genéticas. Célula subsequente triagem do mielóide p caracterizadoopulations ou a sua separação imunomagnética pode ser usado para várias aplicações a jusante, tais como outros estudos sobre gene ou expressão da proteína. A caracterização precisa de neutrófilos, monócitos e microglia obtidos com este método proporciona uma elevada especificidade em relação a métodos existentes, tais como os estudos de imuno-histoquímica, uma vantagem que permite a atribuição de funções específicas para as diferentes células mielóides cérebro que medeiam a resposta imune inata. Além disso, ela pode ser alargada de modo a caracterizar outras populações de cérebro com o rótulo adequado, como através do sangue, macrófagos (CD11b CD45 + CD68 + oi), e pode ser aplicado para o estudo de outras patologias do SNC ou ferimentos. Portanto, esta técnica fornece uma ferramenta essencial para explorar a heterogeneidade da resposta inflamatória no cérebro. A principal limitação desta técnica reside na preparação das suspensões de leucócitos a partir de tecido cerebral fresco, o que pode alterar oestado de activação das células ou das suas alterações antigénio. Embora esta técnica permite uma caracterização qualitativa mais detalhada em relação aos estudos de imuno-histoquímica, ele fornece uma quantificação menos precisas com base em isolamento celular. Apesar disso, a eficiência de nosso protocolo de isolamento de células é semelhante a outras metodologias publicadas e 9 pode ser eficientemente usado para detectar diferenças no número de células do sistema imunológico do cérebro entre o controlo e grupos MCAO ou mesmo entre grupos MCAO submetidos a diferentes tratamentos 8. As etapas críticas do presente protocolo são a dissecção dos tecidos, o procedimento de rompimento do tecido, e a remoção da mielina. Em relação à coleta de tecido, uma etapa de normalização podem ser incluídos (por pesagem do tecido coletado) para evitar a variabilidade devido a diferentes performances de dissecação. Além disso, a normalização entre diferentes grupos MCAO também pode ocorrer através do volume de enfarte (previamente determinada por R Magnéticaesonance). Outra maneira de resolver este problema é a utilização de todo o hemisfério ipsilateral de ambos os grupos isquémicos e de controlo, ou mesmo utilizar o hemisfério contralateral do rato isquémica como controlo, para minimizar o número de animais utilizados. Embora esta abordagem evita a diferenças entre cada dissecção, tem uma desvantagem principal; um factor de diluição é adicionado através do aumento do número total de células, mas não o número de células mielóides, que estão localizados exclusivamente no núcleo e peri-enfarte áreas do córtex ipsilateral. Quanto rompimento do tecido, este protocolo ilustra as etapas para a ruptura mecânica das células do cérebro, evitando tratamentos enzimáticos e prevenir superfície antígeno alteração 9,22, uma questão essencial para posterior análise qualitativa e quantitativa das subpopulações de células inflamatórias. Para além da preparação da suspensão de células de interesse, a remoção de amostras de cérebro de mielina é um passo altamente recomendado para evitar a interferência com downstaplicações resma, como a separação de células imunomagnï¿½ica ou citometria de fluxo 23,24. Isto pode ser realizado através de diferentes métodos, tais sacarose ou gradientes de Percoll, ou grânulos anti-mielina. Aqui, e com base em estudos anteriores que comparam diferentes métodos para isolamento suspensão de células do cérebro, ruptura mecânica em combinação com o uso de Percoll para remover mielina é usado para melhorar a produção e viabilidade celular 25.

Morfológicas fenotípica, e expressão do gene de alterações da microglia, bem como o extravasamento e a activação de macrófagos e neutrófilos haematogï¿½ea Acredita-se que desempenham um papel fundamental na cascata fisiopatológica após lesão cerebral 1-4. Este protocolo prevê duas abordagens para estimar o número de diferentes subpopulações de células mielóides do cérebro isquêmico e para realizar sua caracterização fenotípica. Além disso, também proporciona uma descrição de um modelo experimental de isquemia cerebral em ratos, que consiste na ligação permanente ou transitória de ambas Artéria Cerebral Média distal (ACM) e da artéria carótida comum (ACC), incluindo a forma de avaliar a enfarte pelo método Cavalieri precisa utilizando um software de estereologia. A primeira abordagem para caracterizar as subpopulações de células mielóides do cérebro isquémico é um método de estereologia com base na abordagem de fraccionamento óptico 5. Este é o maiscomumente usado sonda estereologia em ciências da vida e fornece um alto grau de precisão, com baixos coeficientes de erro 5-7. Esta é a melhor escolha para quantificação celular quando o tecido é cortado em secções, uma vez que evita o viés sobre a estimativa da célula devido à fragmentação do tecido em secções. Este método é uma forma muito poderosa para caracterizar os números, a dinâmica e as mudanças fenotípicas de subpopulações de neutrófilos infiltrados do tecido isquêmico 8. A segunda abordagem baseia-se na caracterização de um protocolo modificado a partir Campanella e colaboradores 9 que proporciona um modo simples para isolar suspensões cerebrais de leucócitos e para os caracterizar por citometria de fluxo. Em contraste com técnicas de imunohistoquímica convencionais, citometria de fluxo caracterização permite a diferenciação entre microglia (CD45 lo CD11b +) e infiltrado células mielóides (CD45 oi CD11b +) com base em sua diffos níveis de expressão de CD45 erent 9-13. Além disso, os monócitos pró-inflamatórias (CD45 oi CD11b + Ly-6G - Ly-6C oi), neutrófilos (CD45 oi CD11b + Ly-6G +) e outros subconjuntos de leucócitos no tecido isquémico podem ser distinguidos. Esta abordagem proporciona um ensaio rápido e fiável para avaliar neuroinflamaï¿½o em modelos de isquemia cerebral. No entanto, o processamento de tecidos podem influenciar o estado de activação e os números das diferentes populações de células presentes no tecido isquémico fornecendo uma caracterização semi-quantitativa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Activação da microglia, bem como o extravasamento de neutrófilos e macrófagos haematogï¿½ea, acredita-se desempenhar um papel crucial na lesão cerebral após apoplexia. Estas subpopulações de células mielóides pode exibir diferentes fenótipos e funções e devem ser diferenciadas e caracterizados para estudar sua regulação e contribuição para o dano tecidual. Este protocolo prevê duas metodologias diferentes para cérebro caracterização de células imunes: uma abordagem da estereologia precisa e uma análise de citometria de fluxo. A abordagem estereologia baseia-se no método de fraccionamento da óptica, o qual calcula o número total de células em uma área de interesse (cérebro enfartado) estimada por amostragem aleatória sistemática. A segunda abordagem caracterização oferece uma maneira simples para isolar suspensões de leucócitos cérebro e caracterizá-los por citometria de fluxo, permitindo a caracterização de microglia, monócitos e neutrófilos infiltrados do tecido isquémico. Além disso, também details um modelo de isquemia cerebral em camundongos que afeta exclusivamente córtex cerebral, gerando infartos altamente reprodutíveis com uma baixa taxa de mortalidade, bem como o procedimento para o processamento cerebral histológico para caracterizar o volume de enfarte pelo método de Cavalieri.

O modelo de isquemia cerebral mostrado aqui gera enfarte observados exclusivamente no córtex sem afectar o tecido estriado uma vez que os ramos lenticulostriatal da MCA que irrigam o corpo estriado não são ocluídas (Figura 1). Por coloração de Nissl, a área danificada pode ser identificado como uma área cortical hipocrômico (Figura 2). Este modelo caracteriza-se por os volumes de enfarte altamente reprodutíveis às 24 horas após a MCAO (IH 15,89% ± 0,28) estimada pelo método de Nissl Cavalieri em secções coradas (Figura 2). A estimativa do volume enfartada pelo método Cavalieri é uma abordagem precisa com um erro de baixo que se reflecte no coeficiente de erros (CE) de Gundersen nos hemisférios contralesional e ipsilesional, bem como na área enfartada (Tabela 2). Volume de tecido danificado pode ser expressa em mm 3, mas também como% IH usando a fórmula na secção 3.2.13. Além disso, a estimativado volume total das regiões ipsilesional contralesional e permitem o cálculo do índice do edema para corrigir o volume com enfarte e para evitar uma sobreavaliação do tecido danificado (Tabela 2). Dado o processamento cortes seriados do tecido cerebral, o que pode ser aproveitado para realizar uma estimativa exacta do número total de sub-populações de células, como os neutrófilos infiltrados, na área isquémica, utilizando a abordagem Fracionador óptica (Figura 3 e Tabela 4) com os parâmetros apresentados na Tabela 3. Este protocolo prevê um número total de neutrófilos (glóbulos Ly6G-positivos) na área infartada de 23.328 ± 3.623 às 24 horas e 82.856 ± 8.143 em 48 horas em camundongos após pMCAO (Figura 3D). De acordo com estudos anteriores, a infiltração de neutrófilos está diretamente relacionada com o tamanho do infarto (Figura 3E). Estimativa de tele número de neutrófilos pelo método Fracionador óptica é uma abordagem precisa com um erro baixa que é reflectida pela CE de Gundersen (Tabela 4). O isolamento de leucócitos por citometria de fluxo e caracterização protocolo permite o isolamento de 47.922 ± 23.174 células mielóides do córtex do hemisfério ipsilesional de ratos isquémicos. Este compreende 10-30% do total de eventos encontrados na suspensão de células. A grande maioria dos eventos capturados usando esse protocolo de presente um parâmetro baixo FSC, associado a restos celulares (Figura 4). CD11b coloração mostra que as células CD11b + tem um valor maior do FSC (Figura 4), ​​sugerindo que os detritos celulares não é marcado com este marcador e, como indicado anteriormente, que podem ser excluídos de análises posteriores definindo o limite FSC em 200 9. O montante variável de restos celulares obtidos com este método sugere que as diferenças no processo de amostraing (calendário, conservação de tecidos, a temperatura da amostra, a remoção da mielina eficiente, etc.) podem ser responsáveis ​​por isso. Além disso, também é necessário o uso de filtros de células para evitar a presença de grampos celulares nas amostras; este passo tem de ser feito antes da coloração das células. Usando a estratégia de gating mostrado na Figura 5, que é baseado em CD11b e expressão de CD45, que pode discriminar entre residentes e células mielóides infiltradas no tecido isquémico. Esta população CD11b + aumentos no hemisfério isquêmico quando comparado com o ingênuo e com o grupo sham, em que estas células são geralmente associada a uma baixa expressão de CD45 indicando que microglia está proliferando após isquemia (Figura 4, Figura 5 e Tabela 5) . Esta diferença é provavelmente devido à infiltração de células a partir da periferia, como evidenciado pelo aparecimento de um CD11b CD45 + subpopulação de células oi no cérebro isquémico (Figura 4, A Figura 5 e Tabela 5) que é baixa no número ingênua e em cérebros sham. A contribuição de infiltrados para a população de células CD11b + em isquemia cerebral é um processo muito dinâmico 4. No modelo MCAO por ligadura, que pode variar de 30% a 60% do total de células CD11b +, dependendo do tamanho da lesão e do momento em que a caracterização foi feita. Os neutrófilos, caracterizadas como células Ly-6G +, são a população de células mais numerosas infiltrada encontradas em 24 horas após a MCAO no cérebro isquémico rato usando este modelo de isquemia cerebral, uma vez que compreendem a 70-80% do CD11b CD45 + oi. O restante das células são na sua maioria uma subpopulação de CD11b CD45 + hi Ly-6G - Ly-6C hi monócitos pró-inflamatórias. Neste modelo, a população vai aumentar em número em áreas cerebrais isquémicos de 24 a 48 horas após a MCAO. Figura 1:. O procedimento cirúrgico para a ligadura MCA (A) Após a retracção do músculo temporal, uma pequena craniotomia é realizada no crânio do rato. MCA é ligado por um nó ou um nó corrediço usando uma sutura 9/0. (B) Imagens representativas da lesão cortical gerado pelo modelo MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação do volume de infarto por Cavalieri. (A) Imagens representativas de secções de cérebro coradas Nissl-24 h após a ligadura permanente da MCA. A alta ampliação mostra a área hipocromatic após coloração Nissl queidentifica a área danificada (núcleo) após MCAO. O (PI) região peri-enfarte também é mostrada. (B) Quantificação do volume de enfarte representado como% Hemisfério enfarte (% IH), utilizando o método Cavalieri, em secções coradas Nissl-série, 24 horas após a MCAO (n = 50 murganhos ). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Figura 3: Estereológica quantificação de neutrófilos na área enfartada 24 e 48 horas após a ligação, utilizando o método Fracionador óptica. (A) Imagem representativa de neutrófilos infiltrados (células Ly6G-positivos) na área isquêmica em 24 horas após MCAO. Delimitação mostra a área enfartada. (B, C) ​​Exemplos de um dissector óptico para quantificação de neutrófilos pelo fraccionador óptico. (D) Quantificação de neutrófilos totais da região enfartada em 24 e 48 h (n = 4 ratos). (E)A correlação entre o número de neutrófilos com o tamanho do infarto em 24 e 48 horas após a ligadura MCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Figura 4:. Análise dot-gráfico de dispersão representativas de leucócitos cerebrais obtidos a partir de hemisférios naïve, sham e isquémica (24 horas após a MCAO) sobre a base de parâmetros físicos (SSC e FSC) Uma população de eventos que expressam CD11b (vermelho) foi identificado em todos os grupos. Essa população foi fechado e caracterizados de acordo com a expressão de CD45. As células que expressam níveis baixos de CD45 (verde) estavam presentes no córtex isquémico e não-isquémica cerebral e correspondeu às células microgliais. Em contraste, as células que expressam níveis elevados de CD45 (amarelo) foram apenasencontrada no hemisfério isquêmica e em menor grau no grupo sham. Uma análise mais aprofundada da população oi CD11b + CD45 indica que os neutrófilos (Ly-6G + células, azul) e pró-inflamatórios monócitos (células Ly-6C hi, laranja) são os principais subpopulações de células encontradas no cérebro infiltra 24 horas após o AVC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Figura 5:. Gating estratégias para diferenciar residente de células mielóides infiltradas no tecido isquémico CD11b + células foram primeiro fechado de acordo com a intensidade de fluorescência do isotipo (O). Um gráfico representativo do ponto de suspensões de células do cérebro isquémico é mostrado no canto superior direito do painel. EmAdicionalmente, os valores típicos para o número total de eventos e para o número de CD11b + fenómenos adquiridos usando esta técnica é mostrado (não de células / hemisfério cerebral isquémica;. (A) análise de intensidade de fluorescência de CD45 das células CD11b + é mostrada no painel B. A análise de gráfico representativo do ponto de CD45 e CD11b expressão do CD11b + subpopulação fechado é mostrado no canto superior direito do painel. Além disso, o número típico de células CD45 hi lo CD45 adquiridos por hemisfério cerebral isquêmico usando esta técnica é mostrado (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Parâmetros utilizados para o método de Cavalieri </td></tr><tr><td> Seção de espessura (t) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Fração de amostragem Slice (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Distância entre as seções </td><td> 600 pm </td></tr><tr><td> Espaço da Grelha </td><td> 100 pm </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Parâmetros utilizados para a quantificação da estereologia do tecido enfartado. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Resultados </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Infarto </td></tr><tr><td> Área (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> Volume (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Volume Corrigido para Ao longo da projeção (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), alfa (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Hemisfério Infarto </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Cérebro Edema (Ips Vol / Vol Cont) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Exemplos representativos de volumes contralesional, ipsilesional e infarto pelo método de Cavalieri usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colde span = &quot;2&quot;&gt; parâmetros usados ​​para o fraccionamento da Optical </td></tr><tr><td> Seção Espessura (TSF) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Fração de amostragem Slice (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Contando Quadro Altura </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Contando Largura do quadro </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Tamanho da grade X </td><td> 230 pm </td></tr><tr><td> Tamanho da grade X </td><td> 230 pm </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 pm </td></tr><tr><td> Optical Disector Altura </td><td> 14 mm </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Parâmetros utilizados para a quantificação estereológica de neutrófilos infiltrados após isquemia cerebral com a sonda de fraccionamento da óptica usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Estimativa de neutrófilos pelo Fracionador óptica </td></tr><tr><td> Número de locais de amostragem </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Forma Fator </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Total de marcadores Contado </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Os neutrófilos estimadas por Fracionador Optical </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,09 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Exemplo representativo dos neutrófilos infiltrados estimado após isquemia cerebral com a sonda Fracionador óptica usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Os neutrófilos </td><td> Os monócitos </td><td> Microglia </td></tr><tr><td> Ingénuo </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75,8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1.523 </td></tr><tr><td> Sham 24 hr </td><td> 24.563 ± 5.263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1.124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2.910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 hr </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4,826 ± 1,345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Resultados representativos das células mielóides estimados após a isquemia cerebral com a abordagem por citometria de fluxo.

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Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico.

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

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