Name: stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li><li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods:+the+optical+disector+and+fractionator.">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li><li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans.">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke;+a.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li><li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain.">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li><li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells.">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).</li><li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung:+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area.">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li><li>Hern&#225;ndez-Jim&#233;nez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage.">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li><li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis.">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Y&#233;benes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+overload,+measured+as+serum+ferritin,+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion.">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li><li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent,+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke.">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPAR&#947;+Agonist+Rosiglitazone.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPAR&#947; Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression.">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Церебральный модель ишемии представленные здесь дает очень воспроизводимые объемы инфаркта определяются через 24-48 ч и 7 дней после MCA лигирование различных подходов 8,15,17. Эта модель MCAO имеет низкая смертность (менее 1%) по сравнению с другими, сводя к минимуму количество животных, используемых в исследованиях. Важным шагом для получения этого низкий уровень смертности является поддержание надлежащих условий асептики, чтобы избежать инфекций, которые могут ухудшить выживания после индукции инсульта. Эта модель MCAO не может быть использован только в качестве постоянного модели MCAO, который считается клинически значимых модель для трансляционных исследований 18, но и в качестве временной модели транзиторной перевязки ОСО и MCA с удавкой и задней реперфузии в нужное время 19. Этот метод был успешно использован для мышей и крыс 17,20. Все это свидетельства того, что MCAO перевязкой является высокая универсальная модель церебральной ишемии с несколькими приложениями. Critiкал шаг этого метода является то, что он требует инвазивной хирургии под стереомикроскопом; краниотомия должна быть выполнена очень тщательно, чтобы не повредить скуловой кости, а также MCA. Тем не менее, использование фиктивных животных (которые подвергаются хирургической процедуры, но ОСО и MCA лигирования не выполняется) обеспечивает полезный инструмент для различения хирургической процедуры в зависимости от эффекта. Степень повреждения головного мозга Следуя этой технологии может быть определена количественно несколькими способами. Наш протокол мозга секционирование, прокрашивание Нисслю и последующей оценки объема Кавальери позволяет точного количественного определения поврежденной области и сводит к минимуму количество мышей, используемых в этом типе исследований, поскольку участки последовательного мозга также может быть использован для различных иммуногистохимического анализа. Для лучшего выполнения этой методологии, важно, чтобы выбрать соответствующие параметры, используемые в программном обеспечении стереологии (Таблица 1), которые будут необходимы для оценки йе объем различных регионах по формуле: V = 1 / SSF * F * T * Ер я (SSF является выборочная доля ломтик, Т средняя толщина секций, F является площадь шагом сетки и Ер количество точек, попадающих на структуру). Дистальный MCAO перевязкой могут быть полезны для характеристики проникли лейкоцитов и клеток субпопуляции иммунных 8,13, что участие в воспалительном процессе после повреждения головного мозга 1-4. Здесь мы предлагаем две различные методики для мозга иммунных клеток характеристики, точного стереологического подхода и анализа проточной цитометрии для более подробной характеристики несколько лейкоциты субпопуляции. Воспользовавшись серийным срезов головного мозга, количественное определение общего числа нейтрофилов может быть достигнуто с помощью метода оптической ректификационной 16, который оценивает общее количество клеток с количеством клеток пробы остроумиега Систематическое случайной выборки (SRS) набор объективных виртуальных подсчета пространств, охватывающих всю интересующую нас область, в нашем случае область инфаркта, с равномерным расстоянием между объективными виртуальных Подсчет пробелов в направлениях X, Y и Z. Этот метод обеспечивает точный инструмент для оценки общего числа нейтрофилов в ишемических мозга в разное время после перевязки. Хотя это не показано в данном исследовании, этот протокол также может быть использован для оценки различных субпопуляций нейтрофилов после ишемии и 21 для точного количественного определения любой другой клеточной популяции, найденной в ишемической мозга, как и другие проникли лейкоцитов (моноциты / макрофаги) а также для оценки выживших нейронов или даже нейрогенез количественного после инсульта. Самый важный шаг для точной оценки в необходимой области Выбор соответствующих параметров, как те, показано в таблице 3 для нейтрофилов количественного в зоне ишемии.Эти параметры будут использоваться для обеспечения стереологии рассчитать общее количество позитивных клеток (N) с помощью уравнения N = ΣQ- х 1 / SSF х 1 / ASF х 1 / TSF (ΣQ- является общее количество подсчитанных клеток с ректификационной колонны, SSF является раздел выборки фракция, ASF является пробная площадь фракция, и ФБО толщина доля выборки) 5. Хотя эта методика медленнее, чем другие методы количественного (например, анализ нейтрофилов маркеров на мг ткани, денситометрия представительных изображений или числа нейтрофилов в поле зрения), он имеет преимущество, чтобы быть беспристрастным и прочную технику, которая обеспечивает точное количественная оценка количества клеток. Подход выделение мозга лейкоцитов позволяет одновременно идентификации и количественной оценки нескольких подтипов иммунных клеток без необходимости смещения системы окрашиванием в естественных или генетических манипуляций. После сортировки клеток от характеризуется миелоидной рopulations или их иммуномагнитный разделение может быть использован для нескольких последующих приложений, таких как дальнейших исследований по гена или экспрессии белка. Точную характеристику нейтрофилы, моноциты и микроглии получены с помощью этого метода обеспечивает высокую специфичность по отношению к существующим методам, таким как иммуногистохимических исследований, то преимущество, что позволяет выделить специфические функции в различных миелоидных клеток, которые обеспечивают мозг врожденного иммунного ответа. Кроме того, она может быть дополнительно расширен, чтобы характеризовать других групп мозга с соответствующей меткой, как кровь родилась макрофагов (CD11b + CD45 + CD68 Привет), и он может быть применен для изучения других патологий ЦНС или травмы. Поэтому этот метод обеспечивает необходимый инструмент для изучения неоднородности воспалительной реакции в мозге. Основным ограничением этого метода заключается в подготовке лейкоцитов суспензий из свежих мозговой ткани, которые могут изменитьсостояние активации клеток или их антиген изменения. Хотя этот метод позволяет более подробно качественную характеристику по сравнению с иммуногистохимических исследований, она обеспечивает более точную количественную оценку, основанную на выделении клеток. Несмотря на это, эффективность нашего протокола изолятор похож на других опубликованных методов 9, и он может быть эффективно использован для определения различий в количестве иммунных клеток головного мозга между контролем и MCAO групп или даже между MCAO групп, подвергнутых различных обработок 8. Основные этапы этого протокола рассечения тканей, процедура разрушение ткани, и удаление миелина. Что касается коллекции тканей, шаг нормализации могут быть включены (путем взвешивания ткани, собранной), чтобы избежать изменчивости в связи с различными рассечение выступлений. Кроме того, нормализация между различными группами MCAO также может происходить через объем инфаркта (ранее определяется магнитной Resonance). Другой способ решения этой проблемы заключается в использовании всей ипсилатерального полушария обоих ишемических и контрольных групп, или даже использовать контралатерального полушария ишемического мыши в качестве контроля, чтобы свести к минимуму количество животных, используемых. Хотя такой подход позволяет избежать различий между каждой вскрытия, он имеет главный недостаток; коэффициент разбавления добавляется за счет увеличения общего количества клеток, но не количество миелоидных клеток, которые исключительно расположенных в основных и пригородных инфаркта областях ипсилатеральном мозга. Что касается разрушение ткани, этот протокол иллюстрирует шаги для механического разрушения клеток головного мозга, избегая ферментативные методы лечения и предотвращения поверхностного антигена изменения 9,22, что является важным вопросом для дальнейшего качественного и количественного анализа воспалительных клеток субпопуляций. В дополнение к подготовке клеточной суспензии интереса, удаление миелина из образцов мозга является настоятельно рекомендуется шаг, чтобы избежать помех downstполосный приложения, такие как разделение иммуномагнитной клеток или проточной цитометрии 23,24. Это может быть достигнуто с использованием различных методов, например сахароза или Перколла градиенты, или анти-миелина шарики. Вот и на основе предыдущих исследований, сравнивающих различные методы выделения подвески клеток головного мозга, механическое разрушение в сочетании с использованием Перколла удалить миелина используется для повышения урожайности клеток и жизнеспособность 25.

Морфологические, фенотипические и экспрессии генов изменения микроглии, а также кровоизлияние и активация кроветворных макрофагов и нейтрофилов, как полагают, играют ключевую роль в патофизиологических каскада после травмы головного мозга 1-4. Этот протокол обеспечивает два подхода для оценки количества различных миелоидный клеток подмножеств ишемической мозга и выполняют свою фенотипическую характеристику. Кроме того, он также предоставляет описание экспериментальной модели ишемии головного мозга у мышей, которая состоит из переходного или постоянной перевязкой как дистальной средней мозговой артерии (СМА) и общей сонной артерии (ОСА), в том числе, как оценивать инфаркт по точным методом Кавальери, используя стереологической программного обеспечения. Первый подход, чтобы охарактеризовать миелоидных клеток подмножества ишемического мозга стереологического метод, основанный на ректификационной подход оптического 5. Это наиболееобычно используется стереологической зонд в области наук о жизни и обеспечивает высокую степень точности, с низким коэффициентом ошибок 5-7. Это лучший выбор для мобильного количественного когда ткань разрезают на отрезки, как это позволяет избежать предвзятости оценки клеток из-за фрагментации ткани в разделах. Этот метод является очень мощным средством для характеристики номера, динамику и фенотипические изменения проникли нейтрофилов субпопуляций ишемического ткани 8. Второй подход характеристика основана на модифицированной протокола от Кампанеллы и соавторов 9, что обеспечивает простой способ, чтобы изолировать мозга лейкоцитов суспензий и охарактеризовать их с помощью проточной цитометрии. В отличие от обычных иммуногистохимических методов, проточной цитометрии характеристика позволяет дифференцировать микроглии (CD45 ло CD11b +) и проникли миелоидных клеток (CD45 Привет CD11b +) в зависимости от их разлУровни экспрессии отличны от CD45 9-13. Кроме того, про-воспалительных моноциты (CD45 привет CD11b + Ly-6G - Ly-6C привет), нейтрофилы (CD45 привет CD11b + Ly-6G +) и другие лейкоциты подмножества ишемической ткани можно выделить. Этот подход обеспечивает надежный и быстрый анализ, чтобы оценить нейровоспаления в экспериментальных моделях ишемии головного мозга. Однако, обработка ткани может влиять на состояние активации и численность различных клеточных популяций, найденных в ишемической ткани, обеспечивающей полу-количественных характеристик.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Активация микроглии, а также экстравазация кроветворных макрофагов и нейтрофилов, как полагают, играет ключевую роль в черепно-мозговой травмой после инсульта. Эти миелоидной субпопуляции клеток могут отображать различные фенотипы и функции и должны быть выделены и охарактеризованы изучить их регулирования и вклад в повреждение тканей. Этот протокол обеспечивает два различных методологий для мозга иммунной характеристик клеток: точное стереологической подход и анализ проточной цитометрии. Стереологический подход основан на методе ректификационной оптической, которая вычисляет общее количество клеток в области интереса (инфаркта мозга) оценивается путем систематического случайного отбора. Второй подход характеристика обеспечивает простой способ, чтобы изолировать мозг лейкоцитов суспензий и охарактеризовать их с помощью проточной цитометрии, позволяющий для характеристики микроглии, проникли моноциты и нейтрофилы ишемической ткани. Кроме того, он также дetails мозговой модель ишемии у мышей, что исключительно влияет коры головного мозга, создавая высокую воспроизводимость инфаркты с низким уровнем смертности, а также порядок гистологической обработки мозга, чтобы охарактеризовать объем инфаркта методом Кавальери.

Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Мозга миелоидных клеток характеристика следующие инсульта может быть выполнена стереологии с использованием метода оптического ректификационной колонны, или с помощью проточной цитометрии анализа мозга лейкоциты суспензии. Оба полезные методы, чтобы выполнить точную фенотипическое различие основных миелоидных подмножеств клеток, найденных в ишемической мозга.

Стереологический и проточной цитометрии Характеристика субпопуляций лейкоцитов в моделях переходных или Постоянного церебральной ишемии

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Применение постоянных средней мозговой артерии Лигирование в мышь

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

В режиме реального времени Digital Imaging лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия при ишемии-реперфузии (ИРИ) в мышцах Кремастер Крысы

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Постоянный церебральный окклюзия судна<em&gt; С помощью</em&gt; Двойной лигатура и Перерезка

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Адаптация полуавтоматического циркулирующих опухолевых клеток (СТС) Анализы для клинических и доклинических исследований приложений

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Моделирование Ход у мышей: Постоянный Коагуляция артерии Дистальный средней мозговой

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Количественное нейрососудистой защите После Серийное гипоксического прекондиционирования и переходных средней мозговой артерии Окклюзия у мышей

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Одновременное ПЭТ / МРТ изображений Во мыши гипоксии мозга-ишемии

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Тромботическая хода модели, основанной на переходных гипоксии мозга-ишемии

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Выполнение Постоянная дистального средней мозговой с общей сонной артерии окклюзии у старых крыс по изучению кортикальной ишемии с устойчивым инвалидности

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...