Name: stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.

<ol>
	<li>Chamorro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+acute+stroke.">The immunology of acute stroke.</a> Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Ramlackhansingh, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+after+trauma:+microglial+activation+and+traumatic+brain+injury.">Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury.</a> Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).</li><li>Charleston, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+cell+number+in+the+central+nervous+system+by+stereological+methods:+the+optical+disector+and+fractionator.">Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator.</a> Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).</li><li>Begega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+estimation+of+the+total+number+of+nervous+cells+and+volume+of+medial+mammillary+nucleus+in+humans.">Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans.</a> Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPARgamma+Agonist+Rosiglitazone.+Stroke;+a.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a.</a> Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).</li><li>Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+cells+in+ischemic+rat+brain.">Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain.</a> Stroke. 33, 586-592 (2002).</li><li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells.">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22, 72-85 (1998).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).</li><li>Denker, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+comprised+of+resident+brain+microglia+not+infiltrating+peripheral+monocytes+acutely+after+neonatal+stroke.">Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke.</a> Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).</li><li>Ballesteros, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone-induced+CD36+up-regulation+resolves+inflammation+by+PPARgamma+and+5-LO-dependent+pathways.">Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways.</a> Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).</li><li>Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+Cavalieri+principle+and+vertical+sections+method+to+lung:+estimation+of+volume+and+pleural+surface+area.">Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area.</a> J Microsc. 150, 117-136 (1988).</li><li>Hern&#225;ndez-Jim&#233;nez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+Information+Regulator+1+Protects+the+Brain+Against+Cerebral+Ischemic+Damage.">Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage.</a> Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96, 857-881 (1988).</li><li>Godino, M. E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+ischemic+brain+damage+by+peritoneal+dialysis.">Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis.</a> J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Y&#233;benes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+overload,+measured+as+serum+ferritin,+increases+brain+damage+induced+by+focal+ischemia+and+early+reperfusion.">Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion.</a> Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).</li><li>Sobrado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+lipoxin+A4+by+5-lipoxygenase+mediates+PPARgamma-dependent,+neuroprotective+effects+of+rosiglitazone+in+experimental+stroke.">Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke.</a> J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).</li><li>Cuartero, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N2+Neutrophils,+Novel+Players+in+Brain+Inflammation+After+Stroke:+Modulation+by+the+PPAR&#947;+Agonist+Rosiglitazone.">N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPAR&#947; Agonist Rosiglitazone.</a> Stroke. 44, 3498-3508 (2013).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pfenninger, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+is+not+present+on+neurogenic+astrocytes+in+the+adult+subventricular+zone,+but+on+embryonic+neural+stem+cells,+ependymal+cells,+and+glioblastoma+cells.">CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells.</a> Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).</li><li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression.">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada tanıtılan serebral iskemi modeli son derece tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri 24-48 saat ve farklı yaklaşımlar 8,15,17 tarafından MCA bağlanmasından sonra 7 gün tespit verir. Bu MCAO-modelindeki çalışmalarında kullanılan hayvan sayısını en aza indirir kıyasla düşük bir ölüm oranına (% 1&#39;den az) sahiptir. Mortalite bu düşük oran elde etmek için kritik bir adım strok indüksiyon sonrası hayatta kalma bozabilecek enfeksiyonları önlemek için uygun aseptik koşullarda muhafaza etmektir. Bu MCAO model, aynı zamanda, istenen zamanda, bir ilmek ve arka reperfüzyon ile CCA ve MCA geçici ligasyonu ile bir geçiş model olarak, translasyonel araştırma 18 için klinik olarak uygun model olarak kabul edilen bir sürekli MCAO-modelindeki olarak kullanılamaz 19. Bu yöntem, başarılı bir şekilde fareler ve sıçanlar 17,20 kullanılmıştır. Bütün bu deliller ligasyon ile MCAO çoklu uygulamalarla serebral iskemi, yüksek çok yönlü bir model olduğunu gösterir. Bir critiBu tekniğin cal adım, bir stereo mikroskop altında invaziv cerrahi gerektirir; MCA yanı sıra elmacık kemiği zarar değil gibi Kraniyotomi çok dikkatli yapılmalıdır. Ancak, sahte hayvanların kullanımı cerrahi prosedür bağımlı etkilerini ayırt etmek yararlı bir araçtır sağlar (cerrahi prosedür ama CCA ve MCA ligasyonu tabi tutulur gerçekleştirilmez). Bu teknik, aşağıdaki beyin hasarı derecesi, çeşitli yöntemlerle ölçülebilir. Beyin kesit, Nissl boyama ve Cavalieri hacim daha sonra tahmin protokol hasarlı bölgenin tayini için daha kesin sağlar ve seri beyin kesitleri farklı imünohistokimyasal analiz için kullanılabilir çünkü bu tür çalışmalarda kullanılan farelerin sayısını en aza indirir. Bu metodolojinin daha iyi bir performans için, stereoloji yazılımında kullanılan uygun parametreleri seçmek için kritik (Tablo 1) inci tahmin için gerekli olacakformülü ile farklı bölgelerin e hacmi: V = 1 / ssf * Bir f * t * ΣP i (Ssf t bölümlerin ortalama kalınlığı, dilim örnekleme fraksiyonu, bir f ızgara aralığı alanıdır ve ΣP yapıya vurma noktası sayısı). ligasyon ile uzak MCAO infiltre lökosit ve immün hücre alt-popülasyonunu beyin hasarı 1-4 Aşağıdaki iltihabik sürece katılmaya 8,13 karakterize etmek yararlı olabilir. Burada, beyin, bağışıklık hücre karakterizasyonu, kesin stereolojik yaklaşımla ve daha çok sayıda lökosit subpopülasyonunun karakterize bir akım sitometri analizi için iki farklı metodolojiler öneriyoruz. Seri beyin kesit yararlanan, nötrofil sayısının ölçümü hücrelerinin örneklenmiş zekâ sayısından hücrelerinin toplam sayısını tahmin optik parçalama yöntemiyle 16, elde edilebilirha yol X tarafsız sanal sayım alanlar arasında düzgün mesafe ile bizim durumumuzda, enfarktüs bölgesini ilgi tüm bölgeyi kapsayan tarafsız sanal sayma alanlarda, Sistematik rastgele Sampled (SRS) seti, Y ve Z Bu yöntem doğru bir araç sağlar bağlanmasından sonra farklı zamanlarda, iskemik beyin total nötrofil sayısını belirlemek. Bu çalışmada gösterilmiş olmasına rağmen, bu protokol de iskemi 21 sonra diğer sızmış lökositlerin gibi iskemik beyin bulunan diğer hücre popülasyonunun doğru ölçümü için farklı nötrofil alt popülasyonlarının tahmini için kullanılabilir (monositler / makrofajlar) ve aynı zamanda hayatta kalan nöronlar tahmin ya da inme sonrası nöron ölçümü için. olanlar İskemi bölgesinde nötrofil ölçümü için, Tablo 3&#39;de gösterildiği gibi, arzu edilen alanda, doğru bir tahmin etmek için en önemli adımı, uygun parametreler seçimidir.Bu parametreler (ΣQ- ile sayılan toplam hücre sayısı, N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / tsf denklemi kullanılarak toplam pozitif hücre sayısı (K) hesaplamak için stereoloji yazılımı için kullanılacaktır parçalama, ssf asf örnekleme fraksiyonu alanı, ve TSF örnekleme fraksiyonu kalınlığı) 5 olduğu, bölüm örnekleme bölümüdür. Bu yöntem, diğer ölçüm teknikleri daha düşük olmasına karşın (örneğin, doku, temsili görüntü veya alan başına nötrofil sayısının densitometri mg nötrofil belirteçlerin analizi), bu tarafsız ve kesin sağlayan bir katı madde teknik olma avantajına sahiptir hücre sayıları ölçümü. Beyin lökosit izolasyon yaklaşım bastırılması için ihtiyacı olan in vivo boyama ya da genetik manipülasyonlar sistem olmadan anında belirlenmesi ve çeşitli immün hücre alt-tiplerinin ölçülmesini sağlar. Karakterize miyeloid p gelen sıralama sonraki hücreopulations veya immünomanyetik ayırma gibi gen veya protein ekspresyonu ile ilgili başka çalışmalar gibi çok sayıda alt baş uygulamalar için kullanılabilir. Bu yöntem ile elde edilen nötrofiller, monositler ve mikroglia doğru karakterizasyon immünohistokimyasal çalışmalar, beyin doğuştan gelen bağışıklık tepkisine aracılık farklı miyeloid hücrelerine özel fonksiyonlar tahsis sağlayan bir avantaj olarak, mevcut yöntemlere göre yüksek spesifisite sağlamaktadır. Buna ek olarak, bundan başka, kanla taşınan makrofajlar (CD11 + CD45 yüksek CD68 +) gibi, uygun bir etiket ile diğer beyin popülasyonları için genişletilebilir ve diğer merkezi sinir sistemi patolojileri ve yaralanma çalışma için uygulanabilir. Bu nedenle bu teknik beyindeki inflamatuvar yanıtın heterojeniteyi keşfetmek için önemli bir araç sağlar. Bu tekniğin bir ana sınırlama değiştirebilir olan taze beyin dokusundan lökosit süspansiyonların hazırlanması bulunduğuhücreler veya bunların antijen değişiklik aktivasyon durumu. Bu teknik, immünohistokimyasal çalışmalara kıyasla daha detaylı bir niteliksel nitelenebilmesine olanak veren, ancak bu hücre izolasyonu göre daha az hassas bir ölçümü içerir. Buna rağmen, hücre izolasyon protokolünün etkinliği diğer yayımlanmış metodolojiler 9 benzer ve etkin bir şekilde kontrol ve MCAO gruplar arasında, hatta farklı tedaviler 8 tabi MCAO grupları arasında beyin bağışıklık hücrelerinin sayısında farklılık tespit etmek için kullanılabilir. Bu protokolün kritik adımlar doku diseksiyonu, doku bozulması prosedürü ve miyelin kaldırma vardır. Doku toplama ile ilgili olarak, bir normalleşme adımı nedeniyle farklı diseksiyon performansları değişkenlik önlemek için (toplanan doku tartarak) dahil edilebilir. Buna ek olarak, farklı MCAO grupları arasında normalleştirme da enfarktüs hacmi ile oluşabilir (daha önce manyetik R belirleniresonance). Bu sorunu çözmek için başka bir yolu hem iskemik ve kontrol gruplarının tüm ipsilateral yarımküre kullanmak, hatta kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için bir kontrol olarak iskemik fare kontralateral yarımkürede kullanmaktır. Bu yaklaşım, her diseksiyon arasındaki farklılıkları önler iken, bir ana dezavantajı vardır; Bir seyreltme faktörü sadece aynı taraf korteks çekirdek ve peri-enfarktüs alanları bulunan miyeloid hücrelerin sayısını hücrelerinin toplam sayısının artırılması, ancak ilave edilir. Doku bozulması ile ilgili olarak, bu protokol beyin hücrelerinin mekanik bozulması için adımlar, enzimatik tedaviler kaçınarak ve yüzey antijeni değişiklik 9,22, inflamatuar hücre alt daha kalitatif ve kantitatif analiz için önemli bir sorun önlenmesi göstermektedir. Ilgi hücre süspansiyonu hazırlanması yanı sıra, beyin örneklerinden miyelin çıkarma downst müdahaleyi önlemek için bir tavsiye adımdırBöyle immünomanyetik hücre ayırma veya sitometri 23,24 akış gibi delmek uygulamalar. Bu durum, farklı yöntemler, örneğin sukroz veya Percoll gradyenleri, ya da anti-miyelin boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, ve hücre verimini arttırmak için kullanılan miyelin kaldırmak için Percoll kullanımı ile birlikte beyin hücre süspansiyonu izolasyonu, mekanik bozulma için farklı yöntemler karşılaştırın ve 25 Canlılığına önceki çalışmalara dayanmaktadır.

Morfolojik, fenotipik ve gen ifadesi mikrogliya değişiklikler yanı sıra ekstravazasyon ve hematojen makrofajlar ve nötrofillerin aktivasyonu beyin hasarı 1-4 aşağıdaki patofizyolojik kaskad bir rol oynadığına inanılmaktadır. Bu protokol iki yaklaşım iskemik beyin farklı miyeloid hücre alt sayısını tahmin etmek ve onların fenotipik karakterizasyonu gerçekleştirmek için sağlar. Buna ek olarak, aynı zamanda, nasıl infarkt değerlendirmek için de dahil olmak üzere, her iki distal Orta Serebral Arter geçici veya kalıcı ligasyonu (MCA) ve ortak karotid arter (CCA) oluşur farelerde serebral iskemi deneysel modelinde, bir açıklamasını sağlar stereolojik yazılımı kullanarak doğru Cavalieri yöntemi ile. iskemik beyin miyeloid hücre alt kümelerini karakterize ilk yaklaşım optik parçalama yaklaşımı 5 dayalı bir stereolojik yöntemdir. Bu en çokyaygın yaşam bilimleri stereolojik sonda kullanılan ve hata 5-7 düşük katsayılı hassas bir yüksek derecede sağlar. Çünkü bölüme dokusunun parçalanması hücre tahminine önyargı önler gibi doku, bölümler halinde kesilir Bu hücre ölçümü için en iyi seçimdir. Bu yöntem numaraları, dinamikleri ve iskemik dokuda 8 sızmış nötrofil alt popülasyonlarının fenotipik değişiklikleri tanımlamak için çok güçlü bir yoludur. İkinci karakterizasyon yaklaşımı beyin lökosit süspansiyonları izole etmek ve akış sitometri onları karakterize etmek basit bir yol sağlar Campanella ve ortak 9 bir modifiye protokol dayanmaktadır. Geleneksel imünohistokimyasal teknikler aksine, bunların diff göre miyeloid hücreler (CD45 yüksek CD11b +) Özellikleri (CD45 lo CD11b +) mikroglia arasında ayrım sağlar akış sitometrisi ve infiltreCD45 9-13 erent ifade seviyeleri. Buna ek olarak, pro-enflamatuar monositler (CD45 yüksek CD11b + Ly-6G - Ly-6C yüksek), nötrofil (CD45 yüksek CD11b + Ly-6G +) ve iskemik doku ve diğer lökositler alt grupları ayırt edilebilir. Bu yaklaşım, beyin iskemisi deneysel modellerinde nöro-inflamasyonu değerlendirmek için güvenilir ve hızlı bir deney sağlar. Bununla birlikte, doku işleme aktivasyon durumunu ve bir yarı-kantitatif karakterizasyonu sağlayan iskemik doku içinde bulunan farklı hücre popülasyonlarının numaraları etkileyebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1018">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:215px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Photonic Led F1</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Temp Controller&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Panlab&#160;</td>
			<td style="width:215px;">HB 101/2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Volvere GX</td>
			<td style="width:215px;">NSK</td>
			<td style="width:215px;">Ne22L</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope</td>
			<td style="width:215px;">WPI</td>
			<td style="width:215px;">PZMIII-BS</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stainless Steel Burrs</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">19007-14</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5/45&#160;</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11251-35</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Forceps Dumont #5SF</td>
			<td style="width:215px;">FST</td>
			<td style="width:215px;">11252-30</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 6/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">55108</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Suture 9/0</td>
			<td style="width:215px;">LorcaMarin</td>
			<td style="width:215px;">61966</td>
			<td>Surgical material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Nikon Eclipse&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:215px;">Esteve</td>
			<td style="width:215px;">571329-8</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:215px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:215px;">570681</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:215px;">Leica Microsystems GmbH</td>
			<td style="width:215px;">SM2000R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:215px;">2014-07</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Cresyl violet acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C5042</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Microscope&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:215px;">Nikon Eclipse TE300</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">XYZ motorized computer stage and controller</td>
			<td style="width:215px;">Ludl electronics Products</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Stereo Investigator System</td>
			<td style="width:215px;">Microbrightfield</td>
			<td style="width:215px;">Version 7.003 software</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle</td>
			<td style="width:215px;">Thomas Scientific</td>
			<td>0913X70</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:215px;">Nalgene</td>
			<td>3119-0050&#160;</td>
			<td>Lab material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Percoll</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">p1644-100</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Lonza</td>
			<td style="width:215px;">BE12-702F</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Ultracentrifugue</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti</td>
			<td style="width:215px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">BD 352340</td>
			<td>Lab Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A3733-500G</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FcR Blocking Reagent, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-092-575</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD11b-FITC, human and mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-098-085</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">CD45-PE, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-596</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">Anti-Ly-6G-APC, mouse</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:215px;">130-102-936</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C</td>
			<td style="width:215px;">Biolegend</td>
			<td style="width:215px;">128012</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACS Flow</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342003</td>
			<td>Reagment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD FACSCalibur; 4-color</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;">342975</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">BD Cell Quest Pro Software</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:215px;">Treestar inc.</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereological and flow cytometry characterization of leukocyte subpopulations in models of transient or permanent cerebral ischemia

Mikroglia aktivasyonu, aynı zamanda kan oluşumu, makrofajların ve nötrofillerin ekstravazasyon, felç sonrası beyin hasarına önemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Bu miyeloid hücre alt popülasyonlar farklı fenotipleri ve işlevleri görüntülemek ve seçkin olması gerekir ve doku hasarına onların düzenleme ve katkı çalışma özelliği olabilir. Kesin stereolojik yaklaşım ve bir akım sitometri analizi: Bu protokol beyin bağışıklık hücre karakterizasyonu için iki farklı metodolojiler sağlar. stereolojik yaklaşım sistematik rastgele örnekleme yöntemi ile hesaplanan tahmini faiz (enfarkte beynin) bir alanda hücrelerin toplam sayısını hesaplar optik parçalama yöntemine dayanmaktadır. İkinci karakterizasyon yaklaşımı beyin lökosit süspansiyonları izole etmek ve mikroglianın karakterizasyonu için izin flow sitometri onları karakterize için basit bir yol sunar, monositler ve iskemik doku nötrofillerin sızmış. Buna ek olarak, aynı zamanda, dözel bir ölüm oranı düşük ve Cavalieri yöntemi ile enfarktüs hacmini tanımlamak için histolojik beyin işleme prosedürü ile yüksek oranda tekrarlanabilir infarkt üretilmesi, beyin korteksi etkiler farelerde serebral iskemi modeli etails.

Burada gösterilen serebral iskemi modeli striatum sulama MCA lenticulostriatal kolları (Şekil 1) tıkalı değildir, çünkü striatal doku etkilemeden kortekste sadece görülen infarkt oluşturur. Nissl boyama ile, hasarlı alan bir hipokrom kortikal alanda (Şekil 2) olarak tespit edilebilir. Bu model Nissl-lekeli bölümlerde Cavalieri yöntemi ile tahmin MCAO (% 15.89 ± 0.28 IH) (Şekil 2) 24 saat sonra yüksek tekrarlanabilir enfarktüs hacimleri ile karakterizedir. Cavalieri yöntemi ile infarkt hacmi tahmini contralesional ve ipsilesional hemisferde Gundersen hata (CE) katsayısı hem de infarkt alanı (Tablo 2) yansıyan bir düşük hata ile doğru bir yaklaşımdır. Hasar gören doku hacmi mm 3 hem de bölüm 3.2.13 formül kullanılarak% IH olarak ifade edilebilir. Buna ek olarak, tahminiipsilesional ve contralesional bölgelerin toplam hacminin enfarkte hacim düzeltilmesi için hasarlı dokuya (Tablo 2) olan yüksek değerleri bilmek ödem endeksinin hesaplanmasında sağlar. Beyin dokusunun seri kesit işleme göz önüne alındığında, bu Optik Parçalama yaklaşımı (Şekil 3 ve Tablo 4) kullanılarak, iskemik alanda, infiltre nötrofil gibi, hücre alt tamsayısının doğru tahmin gerçekleştirmek için bir avantaj alınabilir Tablo 3&#39;te gösterilen parametreler ile. Bu protokol, 24 saat sürdürüldü ve pMCAO (Şekil 3D), sonra farede 82.856 ± 8.143 48&#39;de saatte 23.328 ± 3.623 ve infarkt alanı nötrofillerin (Ly6G-pozitif hücreleri), toplam sayısını belirler. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, nötrofil infiltrasyonu doğrudan infarkt (Şekil 3E) ile ilişkilidir. T TahminiOptik Parçalama yöntemiyle nötrofil o sayı Gundersen (Tablo 4) CE tarafından yansıtılır, düşük hata ile doğru bir yaklaşımdır. lökosit izolasyonu ve karakterizasyonu protokolü flow sitometri iskemik farelerin ipsilesional yarımkürenin korteks 47.922 ± 23.174 miyeloid hücrelerin izolasyonu sağlar. Bu hücre süspansiyonu içinde bulunan toplam olayların% 10-30 ihtiva etmektedir. Hücresel enkaz (Şekil 4) ilişkili bu protokolü mevcut düşük FSC parametresi kullanılarak çekilen olayların büyük çoğunluğu. CD11 boyama CD11b + hücrelerinin daha önce belirtildiği gibi bu, 200 9&#39;da FSC eşiği ayarı ile analiz dışında olabilir ki, hücre döküntüsü, bu işaretleyici ile etiketlenmiş olmadığını göstermektedir ve (Şekil 4) daha yüksek bir FSC değerine sahip olduğunu göstermektedir. Bu yöntemle elde edilen hücre enkaz değişebilen miktarda örnek süreci o farklılıkları göstermektediring (zamanlama, doku koruma, örnek sıcaklığı, verimli miyelin kaldırma, vb) bunun için hesap edebilirsiniz. Buna ek olarak, hücre süzgeçler kullanımı da örneklerde hücresel kelepçeler yok etmek için gerekli olan; Bu aşama, hücre boyama için yapılması gerekmektedir. CD11b ve CD45 ekspresyonu göre Şekil 5&#39;te gösterilen yolluk strateji kullanarak, iskemik doku içinde yerleşik ve infiltre miyeloid hücrelerin birbirinden ayırabilir. Iskemik hemisferde bu CD11 + popülasyonu artar (Şekil 4, Şekil 5 ve Tablo 5) saf ve bu hücreler, çoğunlukla mikroglia iskemi sonrası çoğalan gösteren CD45 düşük ekspresyonu ile ilişkili olan plasebo grubu ile karşılaştırıldığında . Iskemik beyin bir CD11b + CD45 yüksek hücre alt-popülasyonu ortaya çıkması ile kanıtlandığı gibi bu fark (nedeniyle çevre hücre infiltrasyonuna Şekil 4, büyük olasılıklaŞekil 5 ve naif ve sahte beyinlerinde az sayıda olan Tablo 5). Beyin iskemi CD11b + hücre popülasyonuna infiltratların katkısı çok dinamik bir süreç 4. Bağlanması ile MCAO-modelindeki olarak,% 30 ila lezyonun büyüklüğüne ve karakterizasyonu yapılmıştır zaman bağlı olarak, toplam CD11b + hücrelerinin% 60 arasında değişebilir. Ly-6G + hücreleri gibi, özelliği Nötrofiller, bunlar CD11b + CD45% 70-80 ihtiva gibi, serebral iskemi, bu model kullanılarak iskemik fare beyninde MCAO 24 saat sonra bulunan en çok infiltre hücre popülasyonu hi. Ly-6C hi pro-inflamatuar monositlerin - hücrelerin geri kalanı çoğunlukla CD11 + CD45 hi Ly-6G bir ICSI&#39;nin vardır. Bu modelde, bu nüfus 24 den MCAO sonra 48 saat iskemik beyin bölgelerinde sayısı artacak. Şekil 1:. MCA ligasyon için cerrahi prosedür, (A) geçici kas retraksiyonu sonra, küçük bir kranyotomi fare kafatası içinde gerçekleştirilir. MCA bir düğüm veya 9/0 sütür kullanarak bir ilmek ile bağlanır. (B) MCAO modeli tarafından üretilen kortikal lezyon Temsilcisi görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg" /> Şekil 2: Cavalieri tarafından infarkt hacmi miktarının belirlenmesi. (A) Nissl-lekeli beyin kesitlerinin Temsilcisi görüntüleri kalıcı MCA bağlanmasından sonra 24 saat. yüksek büyütme Nissl boyama sonra hipocromatic alanı gösterirMCAO&#39;dan sonra hasarlı bölgeyi (çekirdek) tanımlar. Peri-Enfarktüs (PI) bölgesi de gösterilmiştir. (B) (n = MCAO sonra, seri Nissl lekeli bölümlerde 50 fare, 24 saat Cavalieri yöntemi kullanılarak% infarkt Yarımküre (% IH) olarak temsil enfarktüs hacminin sayısallaştırılması ). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg" /> Şekil 3: infarkt alanında 24 nötrofil ve bağlanmasından sonra 48 saat içinde Stereolojik miktar, Optik Parçalama yöntemi kullanılarak. MCAO&#39;dan 24 saat sonra İskemi bölgesinde infiltre edilmiş nötrofil (Ly6G-pozitif hücreleri) (A) Örnek görüntüsü. Sınırlandırılması enfarkte alanı göstermektedir. (B, C) ​​optik parçalama nötrofil ölçümü için bir optik dissektör örnekler. (D) 24 ° C&#39;da enfarkte bölgedeki toplam nötrofil miktar tayini ve 48 saat (n = 4 fare). (E)Enfarktüs 24 boyuta ve MCA bağlanmasından sonra 48 saat ile nötrofil sayısının korelasyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg" /> Şekil 4:. Fiziksel parametreler (SSC ve FSC) temelinde naif, sahte ve iskemik (MCAO sonra 24 saat) hemisfer elde edilen beyin lökositlerin Temsilcisi nokta-arsa dağılım analizi CD11b (kırmızı) ifade olaylar bir nüfus tespit edilmiştir Tüm gruplarda. Bu popülasyon CD45 ekspresyonu göre kapı ve karakterize edildi. CD45 (yeşil) düşük seviyelerde ifade hücreler iskemik ve non-iskemik beyin korteksinde bulunan ve mikrogliyal hücrelere karşılık geldi. Bunun aksine, hücre (sarı) CD45 seviyeleri sentezleyen tektiniskemik yarımkürede ve plasebo grubunda daha az ölçüde bulunamadı. CD11 +, CD45 yüksek nüfusun daha fazla analizi, nötrofil (Ly-6G + hücreleri, mavi) ve pro-enflamatuar monositler (Ly-6C yüksek hücreleri, portakal), ana hücre, beyinde bulunan alt-popülasyonları bulunduğunu inme 24 saat sonra sızan olduğunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">edin Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg" /> Şekil 5:. Iskemik doku infiltrasyonu miyeloid hücreleri yerleşik ayırt etmek için stratejiler yolluk CD11 + hücresi, ilk izotip floresan yoğunluğu (A) &#39;ya göre olan kapı edildi. Iskemik beyin hücre süspansiyonları bir temsilcisi nokta arsa panelinin yukarı-sağ köşesinde gösterilir. IçindeAyrıca, bu tekniği kullanarak elde edilen olayların toplam sayısı ve CD11b + olayların sayısı için tipik değerler (gösterilmiştir hayır hücre / iskemik beyin hemisfer;. (A) CD11b + hücrelerinin CD45 Floresan yoğunluğu analizi panelinde gösterilir kapılı CD11 + alt populasyonun CD45 ve CD11 ifade B. temsilcisi nokta arsa analizi panelinin yukarı-sağ köşesinde gösterilir. Buna ek olarak, iskemik beyin yarımkürede başına elde edilen CD45 lo CD45 hi hücrelerin tipik sayısı bu tekniği kullanarak (B) gösterilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Cavalieri yöntem için kullanılan parametreler </td></tr><tr><td> Bölüm Kalınlığı (t) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Dilim örnekleme fraksiyonu (ssf) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Bölümleri arasındaki mesafe </td><td> 600 mikron </td></tr><tr><td> Izgara Aralığı </td><td> 100 um </td></tr></tbody></table> Tablo 1: enfarkte doku stereolojik ölçümü için kullanılan parametreler. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Sonuçlar </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Enfarktüs </td></tr><tr><td> Konum (μm²) </td><td> 151.460.000 </td><td> 155.060.000 </td><td> 22.600.000 </td></tr><tr><td> Hacim (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Cilt için düzeltildi Projeksiyon üzerinde (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 1 &#39; </td><td> 0.015 </td><td> 0.017 </td><td> 0.015 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), a (k) </td><td> 0.068 </td><td> 0.077 </td><td> 0.067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Enfarktüslü Yarımküre </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Beyin Ödemi (Ips Cilt / Vol Devam) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak Cavalieri yöntemi ile, contralesional ipsilesional ve enfarktüs hacimleri temsili örnekleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colOptik kincinin için kullanılan açıklık = &quot;2&quot;&gt; Parametreler </td></tr><tr><td> Bölüm Kalınlığı (TSF) </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nesnel </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Dilim örnekleme fraksiyonu (ssf) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Çerçeve Yüksekliği Sayma </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Çerçeve Genişliği Sayma </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> X ızgara boyutu </td><td> 230 mikron </td></tr><tr><td> X ızgara boyutu </td><td> 230 mikron </td></tr><tr><td> Güvenli Guard </td><td> 2 um </td></tr><tr><td> Optik Disektör Yükseklik </td><td> 14 um </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak optik parçalama probu ile beyin iskemi sonrasında sızmış nötrofillerin stereolojik ölçümü için kullanılan parametreler. <table border="0" cellpadding="0" cellspadans ediyorum = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Optik parçalama tarafından Nötrofiller Tahmini </td></tr><tr><td> Örnekleme Siteleri Sayısı </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Şekil Faktörü </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Toplam belirteçler Sayılan </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Optik parçalama Tahmin Nötrofiller </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 0 </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> Hata Katsayısı (Gundersen), m = 1 </td><td> 0.09 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Stereo Araştırmacı Yazılımı kullanarak Optik Parçalama probu ile beyin iskemi sonrasında tahmin sızmış nötrofillerin Temsilcisi örneği. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Nötrofiller </td><td> Monositler </td><td> Mikroglia </td></tr><tr><td> Saf </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75.8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1,523 </td></tr><tr><td> Sham 24 saat </td><td> 24.563 ± 5.263 </td><td> 873 ± 192.5 </td><td> 1,124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2.910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 saat </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4826 ± 1,345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tablo 5: yaklaşımla sitometri Akış ile beyin iskemi sonrasında tahmin miyeloid hücrelerin Temsilcisi sonuçları.

Watch this Scientific Journal Video about Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia at JoVE.com

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Fare Daimi Orta Serebral Arter ligasyon Of Uygulama

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Sıçan Cremaster&#39;ın kas iskemi-reperfüzyon Hasarı içinde Lökosit-endotelyal Etkileşim Gerçek zamanlı Dijital Görüntüleme (IRI)

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Kalıcı Serebral Gemi Tıkanıklığı<em&gt; Ile</em&gt; Çift Ligature ve transeksiyonu

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Farelerde Modelleme İnme: Distal Orta Serebral Arter Daimi Pıhtılaşma

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Fare Serebral Hipoksi-iskemi sırasında Eşzamanlı PET / MR Görüntüleme

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Geçici Serebral Hipoksi-iskemi Dayalı Bir Trombotik İnme Modeli

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Yaşlı Sıçanlarda Ortak Karotis Arter Tıkanıklığı ile Kalıcı Distal Orta Serebral Sahne Kortikal İskemi Sürekli Engelli Eğitim için

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...