Name: multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة من المؤسسة الألمانية للعلوم (DFG، Ro2327 / 6-1) لمجلس طعون اللجوء الكتاب أود أن أشكر S. Durry وC. Roderigo للحصول على المساعدة الفنية من الخبراء، وM. Dübbert (مختبر الالكترونيات، معهد علم الحيوان ، جامعة كولونيا، ألمانيا) للمساعدة في تنفيذ وحدة تحكم خلية Pockels والتبديل HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المتنافسة. تلقت الدعم المالي الكتاب تمكن الفتح النشر صول راب البصري (فيدل، ألمانيا)، والتي تنتج الأداة المستخدمة في المقالة الفيديو. كانت الشركة لا تشارك في التجارب ولا في معالجة البيانات ولا في كتابة المخطوطة.

وتظهر هذه الدراسة أن SBFI مناسب تماما لاثنين من الفوتون التصوير من العابرين الصوديوم داخل الخلايا في مقصورات الخلوية الصغيرة. لا بد من وضعها في الاعتبار، مع ذلك، أن كفاءة الكم من SBFI منخفضة نوعا ما 15 والنسبية تغييرات في تركيز الصوديوم صغيرة جدا مع النشاط الفسيولوجي. وبالتالي، عالية الدقة قياس نا + العابرين في عمليات الجميلة هو مهمة شاقة نسبيا، وbinning أو المتوسط ​​من عدة محاكمات قد يكون من الضروري الحصول على إشارات مرضية. بالإضافة إلى ذلك، حركية العابرين الصوديوم بطيئة المستغرب، مما يجعلها واجبة لتسجيل لفترات زمنية ممتدة. هذه الملاحظة يتوافق مع تلك في الدراسات السابقة، حيث تميزت تسوس monoexponential العابرين الصوديوم في التشعبات العصبية والخلايا النجمية من الثوابت في الوقت تسوس كبيرة في حدود 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة 1،2،6. هكذا يبدو العابرين الصوديوم لممارسة أبطأ بكثير الساعة شاركurse وأكبر من ذلك بكثير الثوابت الوقت تسوس بالمقارنة مع العابرين الكالسيوم 16. تخصيص هذه العيوب، والتصوير الصوديوم يبرهن على أن تكون أداة قيمة للتحقيق في الخصائص الفيزيولوجية العصبية من النطاقات الفرعية. على سبيل المثال، يمكن التصوير الصوديوم يخدم لمراقبة نشاط متشابك مثير في أو بالقرب من نقاط الاشتباك العصبي نشطة. لأن الصوديوم أساسا لا مخزنة 8،17، العابرين الصوديوم الناجم عن النشاط ترتبط خطيا إلى مجموعة واسعة من الافراج عن الغلوتامات متشابك أو تطبيقها خارجيا الغلوتامات. وبالتالي فإنها تمثل المؤشرات المباشرة وغير متحيزة النشاط الجلوتامين العصبية. وعلاوة على ذلك، والأصباغ مؤشر الصوديوم تظهر ارتفاع K ل د (K د SBFI هو في حدود 25 ملي 1). حتى في تركيزات عالية نسبيا صبغ الخلايا المستخدمة لتحقيق سطوع كافية (عادة 0،5-1 ملم)، وارتفاع K &#39;د ق يعني أن الأصباغ أنفسهم لا تعمل كحواجز لقالكراهية. وبالتالي، فإنها لا تشوه بالطبع السعة ولا وقت العابرين الصوديوم، الذي هو دائما مصدر قلق عندما يتم إدخال الأصباغ الحساسة الكالسيوم في الخلايا 18. ومن ثم يمكن افتراض أن الكشف عن إشارات تمثل مقياسا جيدا للتغييرات &quot;حقيقية&quot; في الصوديوم داخل الخلايا. البطيء دوام ثم يعني أن سرعة الانتشار داخل الخلايا للالصوديوم في الخلايا العصبية هي أصغر بكثير مما كان يفترض سابقا 19. وهناك شرط حاسم للتنفيذ الناجح من التجارب معالجة خصائص مثير متشابك انتقال وتدفق الصوديوم مسارات في العمود الفقري والتشعبات هو تحريض على تفعيل سريع وموضعي للغاية من الهياكل بعد المشبكي. هذا ويمكن الحصول على التطبيق السريع والمحلية من الغلوتامات أو الغلوتامات منبهات في المنطقة المجاورة مباشرة من العمود الفقري أو التغصنات قبل التحلل الضوئي فلاش من المركبات في قفص. فلاش التحلل الضوئي لا داما لا ميكانيكياجنرال الكتريك الأنسجة، خالية من القطع الأثرية الحركة وراسخة للتحقيق في المسائل ذات الصلة (مثل إشارات الكالسيوم المحلية). كان قطرها من 1.5 ميكرون uncaging بقعة في الطائرة س ص. على مقربة Uncaging إلى إشارات الصوديوم شائك يسببها التغصنات في كل من العمود الفقري والتغصنات الأم. في حين أن إشارات تميل إلى أن تكون أكبر في العمود الفقري الأقرب إلى بقعة uncaging، لا تزال السعات في التغصنات الأم والعمود الفقري وليس بعيدا مماثلة لتلك الموجودة في المناطق المجاورة مباشرة للبقعة uncaging. تم تنفيذ Uncaging ل300 ميللي ثانية خلالها زيادة في السعة التيارات الداخل. الغلوتامات Uncaged قد تنتشر في الأنسجة خلال نفس الفترة الزمنية، وتفعيل مستقبلات الغلوتامات ionotropic وتدفق الصوديوم في المناطق شجيري العمود الفقري وبعيدا عن بقعة uncaging. مشكلة الجوهرية التي تحدث عند استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لالتحلل الضوئي للمركبات في قفص تدار من خلال حل الاستحمام خليةهو &#39;تصفية الداخلية. بسبب ارتفاع معدل امتصاص من القفص، والموهن ضوء الأشعة فوق البنفسجية بقوة على طول الطريق من الهدف الى الموقع التحفيز 20،21. وهناك طريقة ممكنة لتجنب ذلك هي نضح المحلي مع القفص الذي يقتصر فقط على الموقع التحفيز، مما يقلل كذلك كمية مركب قفص بحاجة إلى الحد الأدنى. بالمقارنة مع uncaging بوساطة الليزر المسح الضوئي للأشعة فوق البنفسجية، القريب من الأشعة تحت الحمراء ثنائي الفوتون uncaging 22 غير مكانيا أكثر دقة، وذلك بسبب دقة التحفيز هو زيادة في محور ض. من ناحية أخرى، وذلك بسبب شريحة صغيرة من أقفاص تستخدم عادة لأطوال موجية أطول كما يعمل مع اثنين من الفوتون الإثارة، إما على نسبة عالية من المركب قفص أو عالية للغاية، وهناك حاجة شدة الضوء يحتمل الضوئية. أيضا، واثنين من الفوتون uncaging يتطلب استثمارا أكبر بكثير في المعدات؛ من بين أمور أخرى، وهناك حاجة ليزر الأشعة تحت الحمراء إضافية بالإضافة إلى المكونات البصرية المطلوبة،. كلا SBFI وMNI-الغلوتامات ومنفعل في نطاق الطول الموجي متطابقة. وهذا قد يؤدي إلى الاعتماد المتبادل غير مقصود من الأشعة فوق البنفسجية والليزر uncaging SBFI أو ليزر الأشعة تحت الحمراء والتصوير MNI-الغلوتامات، مما أدى إلى تبييض SBFI من قبل فلاش uncaging و / أو uncaging المستمر من الغلوتامات بواسطة شعاع الأشعة تحت الحمراء. لكن، وكما هو مبين في الشكل 6C، لا الأشعة فوق البنفسجية ومضة في حد ذاته ولا الفوتون التصوير متعددة تسبب هذه الآثار المتبادلة تحت ظروف تجريبية لدينا. وتستخدم أنظمة الأشعة فوق البنفسجية فلاش مماثلة لتلك الموصوفة هنا بصورة روتينية في العديد من المختبرات الأخرى، ويمكن بسهولة نسبيا أن تدمج في أي المجهر التصوير متعدد الفوتون القائمة. فهو يقدم ميزة أن شعاع الليزر لالتحلل الضوئي يمكن وضعه بحرية في مجال الرؤية. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح النظام لاعادة تموضع سريع والآلي من شعاع الليزر وحجم الإصدار، على التوالي، في مجال الرؤية أثناء التجربة. أويحييص التعديل يبسط ويحسن دقة تحديد المواقع من بقعة uncaging، بحيث إطارات من برامج التصوير يمكن أن تخدم لضبط الإطارات التصوير وuncaging بشكل متطابق. أخذت معا، خلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد الفوتون التصوير الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية المركزية، جنبا إلى جنب مع إجراء تعديل للأشعة فوق البنفسجية التي يسببها الخفيف uncaging الغلوتامات، يسمح موثوقة وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة. وبالتالي فإنه يمكن أن تعمل على تحليل خصائص انتقال متشابك مثير والإشارات الصوديوم بعد المشبكي في الخلايا العصبية في أنسجة سليمة.

وقد مكنت التحسينات الأخيرة في التقنيات المجهرية الخفيفة مثل متعدد الفوتون المجهري دراسة المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية للخلايا الدماغ في أنسجة سليمة مع القرار المكانية والزمانية عالية. جنبا إلى جنب مع الكهربية، والآن تستخدم على نطاق واسع هذه التقنيات لتحليل الإشارات ذات الصلة النشاط الكهربائي في الخلايا العصبية وكذلك إشارات الكالسيوم مصاحبة في مقصورات التحت خلوية صغيرة، وبالتحديد في التشعبات الدقيقة والعمود الفقري شجيري. بالإضافة إلى العابرين الكالسيوم، النشاط متشابك يدفع أيضا إشارات الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري، والخصائص التي هي غير مستكشفة إلى حد كبير. ويمكن تحليل هذه الإشارات بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الصوديوم داخل الخلايا ([نا +] ط) والتي تمكن القياس على الخط من [نا +] ط العابرين لفترات طويلة دون تبييض صبغة كبير أو الصور الضرر 1،2. للتصوير من [نا +] ط </الفرعية&gt;، ليست سوى عدد قليل من الأصباغ الكيميائية مؤشر المتاحة، مثل كورونا الأخضر أو الأخضر اشانتي الصوديوم 3،4. التحقيق الفلورسنت الأكثر استخداما لنا + التصوير هو isophthalate benzofuran (SBFI) ملزم الصوديوم. وهو ratiometric، الأشعة فوق البنفسجية صبغ متحمس مماثل لمعروفة الصبغة الحساسة للالكالسيوم FURA-2، وقد استخدمت لالتقليدي نا + التصوير في العديد من أنواع الخلايا (على سبيل المثال 5،6). هناك احتمالات مختلفة من المثير للصباغة وجمع مضان لها. إذا كان مطلوبا قرار زمنية عالية (أي معدل الإطار التصوير عالية) في تركيبة مع المعلومات المكانية، ويمكن SBFI تكون سعيدة مع مصباح زينون قوس أو عالية الطاقة الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) وجهاز الكشف عن الانبعاثات ذات شحنة عالية السرعة -coupled جهاز (CCD) وكاميرا 7،8. عن القرار المكانية القصوى في عمق الأنسجة، والمسح الضوئي ليزر متعدد الفوتون المجهري هو الأسلوب المفضل 9. وefficie الكم منخفضة نسبياNCY من SBFI يتطلب تركيزات عالية نسبيا صبغ (0،5-2 ملم)، وتحميل مباشر من شكل غشاء كتيمة من SBFI عبر حادة مسرى مكروي 10 أو التصحيح ماصة 1. باستخدام SBFI أظهر العمل في وقت سابق أجريت في شرائح الأنسجة الحادة للالحصين القوارض العابرين الصوديوم ذات الصلة النشاط في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية CA1 الهرمية التي هي سبب رئيسي من تدفق الصوديوم من خلال ionotropic NMDA مستقبلات 1،2. لدراسة خصائص هذه الإشارات الصوديوم المحلية في مزيد من التفاصيل، وتفعيل محدد من المستقبلات بعد المشبكي بتطبيق منبهات مستقبلات هي طريقة مناسبة تماما في الاختيار. لتقليد النشاط قبل المشبكي وإطلاق الإرسال، يجب أن يكون تطبيق وجيزة نسبيا، وركز لتمكين التحفيز المحلي. هذا، ومع ذلك، يبرهن على أن تكون صعبة جدا في أنسجة سليمة. تطبيق الضغط المحلي للمنبهات مستقبلات باستخدام ماصة ذات الرؤوس غرامة تمكن ا ف ب البؤري جداالثني، ولكن يستضيف المخاطر المحتملة لإنتاج حركة هيكل الفائدة (على سبيل المثال مثل التغصنات أو العمود الفقري شجيري)، وبالتالي يعيق التصوير ذات الدقة العالية. مدى ملاءمة الرحلان الشاردي للمواد العصبية نشطة تعتمد على خصائصها الكهربائية وسعة الحالية المرتفعة قد تنتج القطع الأثرية الخلوية أيضا. طريقة واحدة للتغلب على هذه العقبات هي توظيف المركبات تنشيط التحلل الضوئي للصور وفلاش بهم. أساسا، وتستخدم اثنين من مبادئ مختلفة عن الصور تفعيل المواد قفص: I) حقل واسع التحلل الضوئي فلاش 11 والثاني) uncaging البؤري توظيف وحدات المسح في تركيبة مع الليزر 12. في حين يستخدم واسعة المجال التحلل الضوئي فلاش لتنشيط مناطق أكبر من الفائدة، مثل خلية بأكملها، ويعمل uncaging البؤري لتحفيز تحديدا مقصورات الخلوية الصغيرة. في هذه الدراسة نظهر إجراء لخلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد صالتصوير الصوديوم hoton في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية المركزية، جنبا إلى جنب مع إجراء تعديل لالناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ضوء uncaging الغلوتامات، والذي يسمح موثوق بها وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

وقد مكن متعددة الفوتون مضان المجهري تحليل المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية للخلايا الدماغ في أنسجة سليمة مع القرار المكانية والزمانية عالية. جنبا إلى جنب مع الكهربية، ويستخدم على نطاق واسع لدراسة اشارات الكالسيوم المتعلقة النشاط في مقصورات التحت خلوية صغيرة مثل التشعبات والعمود الفقري شجيري. بالإضافة إلى العابرين الكالسيوم، النشاط متشابك يدفع أيضا إشارات الصوديوم بعد المشبكي، خصائص التي تفهم بشكل هامشي فقط. هنا، نحن تصف طريقة لمجتمعة خلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد الفوتون التصوير الصوديوم في المجالات الخلوية الصغيرة من الخلايا العصبية المركزية. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إجراء تعديل لفوق البنفسجية (UV) uncaging خفيفة الناجم عن الغلوتامات، والذي يسمح موثوق بها وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة. ولهذه الغاية، أجريت تسجيلات خلية كاملة على كورنو آمون تقسيم 1 (CA1) الخلايا العصبية الهرمية في شرائح الأنسجة الحادة للالحصين الماوس. امتلأت الخلايا العصبية مع صبغة الفلورسنت SBFI الحساسة الصوديوم من خلال التصحيح، ماصة، ومتعدد الفوتون الإثارة من SBFI تمكين التصور من التشعبات والعمود الفقري المجاورة. لإنشاء uncaging البؤري الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، وجرى اختبار العديد من المعلمات بما في ذلك شدة الضوء، وحجم المتضررين من شعاع uncaging الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد المواقع من الحزم وكذلك تركيز المركب في قفص والأمثل. نتائجنا تظهر ان نضح المحلي مع الغلوتامات قفص (MNI-الغلوتامات) والتنسيق نتيجة للأشعة فوق البنفسجية uncaging في تيارات الداخل والعابرين الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري. بالطبع الوقت وسعة كل التيارات الداخل وإشارات الصوديوم ترتبط مع مدة نبض uncaging. وعلاوة على ذلك، تظهر نتائجنا أن الإشارات الصوديوم داخل الخلايا يتم حظر بحضور حاصرات مستقبلات الغلوتامات لionotropic، مما يدل على أنهم بوساطة تدفق الصوديوم على الرغم من هذا المسار. باختصار، يوفر طريقة لدينا أداة موثوقة لالتحقيق في إشارات الصوديوم داخل الخلايا الناجم عن تنشيط مستقبلات البؤري في أنسجة المخ سليمة.

في هذه الدراسة، نحن يبرهن على وجود إجراءات متعددة الفوتون المجهري للديناميات الصوديوم الخلوية مع الفلورسنت SBFI صبغ تعتمد على الصوديوم في الخلايا العصبية الهرمية CA1 من الماوس الحاد شرائح الأنسجة قرن آمون. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا كيفية الجمع بين هذه التقنية التصوير مع uncaging على الليزر المسح الضوئي للمركبات العصبية نشطة (مثل الغلوتامات قفص) ولها دقة استهداف الخلوية المجالات الدقيقة. تحميل الخلايا العصبية مع SBFI من خلال التصحيح، ماصة مكنت تصور الخلية بأكملها بما في ذلك العمود الفقري والتشعبات غرامة المجاورة عن طريق استخدام متعدد الفوتون الإثارة (الشكل 6A، B، D و الشكل 7A). <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. إشارات الصوديوم والتيارات متشابك الناجمة عن التحلل الضوئي فلاش الغلوتامات في قفص. (A) مكسيمآل صورة الإسقاط من الخلايا العصبية الهرمية CA1 محملة SBFI عبر ماصة التصحيح (PP). يشير مربع المساحة المبينة الموسع في B. LP تدل على موقف وتوجه من ماصة للنضح المحلي من الغلوتامات في قفص. (B) عالية الطاقة الإسقاط أقصى كومة من المقاطع البصرية من التغصنات مع العمود الفقري شجيري المجاورة. خضعت رزمة من المقاطع البصرية Z-المواءمة وdeconvolution. الصليب الأحمر إلى المنطقة المستهدفة من الحزم uncaging. خط منقط البرتقال يحدد المنطقة من الاهتمام من الذي سجلت الانبعاثات مضان. المربع يشير إلى المنطقة الموضحة في توسيع D. (C) اليسار: إشارة الصوديوم (الصف العلوي) وجسدية الداخل الحالي (الصف السفلي) الناجمة عن التحلل الضوئي فلاش الغلوتامات قفص (المشار إليها فلاش الأصفر). الخط الأحمر يمثل نوبة من البيانات التجريبية. وتمثل المنطقة الرمادية الفترة التي فلاش uncaging (300ميللي ثانية) عرقلة التصوير من SBFI مضان اليمين:. دون شروط مسبقة، نضح مع الغلوتامات في قفص، نفس UV-FLASH لا أثار تغييرا في الانبعاثات SBFI، ولا تيار الداخل (D) اليسار: صورة السلطة العليا من التغصنات والمناطق المجاورة العمود الفقري كما يرسم في B. جانب، ونفس الصورة مع القيم الرمادية مقلوب. الخطوط المنقطة تشير إلى مناطق الاهتمام الذي سجلت الانبعاثات مضان. الصليب الأحمر يشير إلى توطين شعاع uncaging اليمين:. العابرين الصوديوم الناتجة عن التحلل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية فلاش الغلوتامات في قفص. الأزرق التتبع: إشارات الصوديوم في التغصنات. أثر الأحمر: متوسط ​​استجابة من ثلاثة أشواك المحاذية للبقعة uncaging. أثر الأخضر: متوسط ​​استجابة من ثلاثة أشواك بعيدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لنسخة أكبر من هذا الرقم.</a> بعد نضح المحلي مع محبوسالغلوتامات، تطبيق الأشعة فوق البنفسجية فلاش قريب من التغصنات أدى إلى انخفاض عابر في مضان الانبعاثات من SBFI، مما يعكس زيادة في تركيز الصوديوم داخل الخلايا (الشكل 6C، D والشكل 7B). في الوقت نفسه، سجلت تيار الداخل في سوما (الشكل 6C والشكل 7B). زيادة مدة فلاش الأشعة فوق البنفسجية نتج عنها زيادة في سعة من كل من أثار الداخل التيارات والإشارات الصوديوم (البيانات لا تظهر)، مشيرا الى ان النظام كان جيدا داخل النطاق الديناميكي والتي كانت مشبعة الردود لا uncaging ولا الخلوية. تطبيق الأشعة فوق البنفسجية فلاش لمدة مماثلة أو أطول للشرائح التي لم perfused لقبل مع الغلوتامات في قفص، أبدا أثار التغيرات في SBFI مضان ولا التيارات الداخل، مشيرا إلى أن هذه الإشارات هي نتيجة لuncaging من الغلوتامات (الشكل 6C). وعلاوة على ذلك، تظهر هذه النتائج أنه لا يوجد ترابط مكونات imaging- وuncaging لوحظ شالتانجو الظروف التجريبية لدينا. ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن إشارات الصوديوم في العمود الفقري شجيري (الشكل 6D). في حين أننا لم محاولة لتحقيق التحفيز من العمود الفقري واحد فقط مع الغلوتامات uncaging، تميل سعة الذروة إلى أن تكون أعلى قليلا في العمود الفقري بالقرب من بقعة uncaging، في حين أن العمود الفقري بعيدا أظهرت التغيرات مضان متطابقة تقريبا كما التغصنات الأم (الشكل 6D). أخيرا، درسنا مسارا لتدفق الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري ردا على uncaging من الغلوتامات. ولهذه الغاية، قمنا بتوظيف CNQX وAPV، التي هي حاصرات انتقائية للمستقبلات الغلوتامات الصوديوم قابلة للاختراق، ionotropic من AMPA- وNMDA-النوع الفرعي، على التوالي. نتائجنا تظهر أن الإشارات بين الخلايا الصوديوم الغلوتامات التي يسببها والتيارات الجسدية أثارت حذفت في وجود هذه حاصرات (الشكل 7B). عند غسل التدريجي من حاصرات، واستعاد الإشارات. هذا يدل ثار uncaging ينشط مستقبلات الغلوتامات الغلوتامات ionotropic على الخلايا العصبية الهرمية CA1، الذي توسط في تدفق الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري، مما أدى إلى العابرين الصوديوم داخل الخلايا والتيارات الداخل. <img alt="الرقم 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> الرقم 7. الشخصية الدوائية إشارات الصوديوم أثار والتيارات الداخل. (A) مليئة SBFI CA1 الخلايا العصبية الهرمية مع ماصة التصحيح (PP) الملحق سوما (B) اليسار: عابر الصوديوم والتيار الجسدية الناجمة عن الصور تفعيل الغلوتامات في قفص في التغصنات والعمود الفقري مركز المرفقة: الإرواء مع ionotropic حاصرات مستقبلات الغلوتامات CNQX وAPV يمنع كل من إشارة الصوديوم والتيار الداخلي الناجم عن uncaging اليمين: وعند غسل التدريجي من حاصرات، تتم استعادة الإشارات. وتمثيلا خط أحمرنهاية الخبر نوبة من البيانات التجريبية. وتمثل المنطقة الرمادية الفترة التي فلاش uncaging (300 ميللي ثانية) عرقلة التصوير من SBFI مضان. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لنسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

وصفنا الجمع بين البؤري الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية الصور تفعيل مركبات العصبية نشطة مع خلية كاملة التصحيح، المشبك والتصوير متعدد الفوتون من العابرين الصوديوم داخل الخلايا في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية قرن آمون في شرائح الأنسجة الحادة للدماغ الفأر.

متعددة الفوتون بين الخلايا التصوير الصوديوم جنبا إلى جنب مع بوساطة الأشعة فوق البنفسجية Uncaging البؤري من الغلوتامات في الخلايا العصبية الهرمية CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

التصوير الضوئي للخلايا العصبية في العقدة كراب فموي معدي مع الجهد حساسة للملونات

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

وهناك طريقة للتحكم عالي الدقة Optogenetic من الخلايا العصبية الفردية الهرمية<em&gt; في الجسم الحي</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

الاستجواب وظيفية من الكبار طائية تكوين الخلايا العصبية مع البؤري الإشعاعية تثبيط

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

الخلايا العصبية الشمية التي يتم الحصول عليها من خلال الأنف خزعة جنبا إلى جنب مع الليزر والتقاط تسليخ مجهري: نهج المحتملين لدراسة الاستجابة للعلاج في اضطرابات العقلية

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع<em&gt; التوكسوبلازما</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

جنبا إلى جنب علم البصريات الوراثي وتجميد كسر طبق الاصل Immunolabeling لدراسة ترتيب المدخلات معين من الغلوتامات المستقبلات في اللوزة ماوس

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...