Name: multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הגרמנית למדע (DFG, Ro2327 / 6-1) לCRR המחברים מבקשים להודות ס Durry וג רודריגו לקבלת סיוע טכני מומחה, ומ &#39;Dübbert (אלקטרוניקה מעבדה, הזואולוגי מכון , האוניברסיטה של ​​קלן, גרמניה) לעזרה ביישום בקר תא Pockels ומתג HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים. המחברים קיבלו תמיכה כספית המאפשרת פרסום גישה פתוח על ידי ראפ אופטו (ודל, גרמניה), אשר מייצר מכשיר המשמש במאמר זה וידאו. החברה לא הייתה מעורבת בניסויים ולא בטיפול בנתונים ולא בכתיבת כתב היד.

המחקר הנוכחי מראה כי SBFI הוא גם מתאים לשני פוטונים הדמיה של עוברי נתרן תאיים בתאים סלולריים קטנים. יש לה להיות כל הזמן לזכור, עם זאת, כי היעילות הקוונטית של SBFI היא נמוכים למדי 15 ויחסי שינויים בריכוז הנתרן הם די קטנים עם פעילות פיזיולוגית. לפיכך, מדידה ברזולוציה גבוהה של עוברי Na + בתהליכי קנס היא משימה יחסית משעממת, וbinning או מיצוע של מספר ניסויים שתידרש כדי להשיג אותות משביעות רצון. בנוסף, קינטיקה של עוברי נתרן היא איטית באופן מפתיע, מה שהופך את החובה להקליט לתקופות זמן ממושכות. תצפית זו מקבילה לאלה במחקרים קודמים, שבו ריקבון monoexponential של עוברי נתרן בדנדריטים עצביים ובהאסטרוציטים התאפיינו בקבועי זמן דעיכה גדולים בטווח של 10 שניות בטמפרטורת חדר 1,2,6. נראה ארעיים נתרן ובכך להפעיל שיתוף זמן הרבה יותר איטיurse וקבועי זמן דעיכה הרבה יותר גדולים בהשוואה לארעית סידן 16. מניח בצד חסרונות אלה, הדמיה נתרן מוכיחה להיות כלי רב ערך לחקירת תכונות פיסיולוגיות של תחומי משנה עצביים. לדוגמא, הדמיה נתרן יכולה לשמש כדי לעקוב אחר פעילות הסינפטית מעוררת באו בסמוך לסינפסות פעילה. בגלל נתרן הוא בעצם לא נאגר 8,17, ארעיים נתרן מושרה פעילותם באופן ליניארי הקשורים למגוון רחב של שחרור גלוטמט הסינפטי או אקסוגני מיושם גלוטמט. הם מכאן מייצגים אינדיקטורים ישירים ובלתי משוחד של פעילות glutamatergic עצבית. יתר על כן, צבעי מחוון נתרן תערוכה של ד K הגבוה (ד K של SBFI הוא בטווח של 25 1 מ&quot;מ). אפילו בריכוזי הצבע תאיים גבוהים יחסית המשמשים להשגת בהירות מספקת (בדרך כלל 0.5-1 מ&quot;מ), ד הגבוה K של לרמוז כי הצבעים עצמם אינם פועלים כמאגרים ליםגנות. כתוצאה מכך, הם לא לעוות כמובן משרעת ולא זמן של עוברי נתרן, שהוא תמיד דאגה כאשר צבעי סידן רגיש הם הציגו לתוך התאים 18. מכאן ניתן להניח כי האותות שאותרו מייצגים מידה טובה של השינויים &quot;האמיתיים&quot; בנתרן תאיים. כמובן הזמן האיטי שלהם ואז משתמע כי המהירות לדיפוזיה תאית לנתרן בתאי עצב היא הרבה יותר קטנה מאשר להניח 19 בעבר. דרישה קריטית עבור הביצוע המוצלח של ניסויים העוסקים במאפיינים של מסלולי הולכה וזרם נתרן הסינפטי מעוררים לתוך עמוד השדרה ודנדריטים היא האינדוקציה של הפעלה מהירה ומקומית מאוד של מבני postsynaptic. ניתן להשיג זאת על ידי יישום מהיר והמקומי של אגוניסטים גלוטמט או מונוסודיום בסביבה הישירה של עמוד השדרה או דנדריט ידי photolysis הבזק של תרכובות כלוב. photolysis פלאש עושה dama לא מכאניge הרקמות, ללא תשלום של חפצי תנועה ומבוסס היטב לחקירה של שאלות קשורות (למשל איתות סידן מקומית). הקוטר של נקודת משחררות הרפרוף היה 1.5 מיקרומטר בxy-המטוס. קרוב משחרר רפרוף לאותות נתרן דנדריט הקוצני מושרה בשני הקוצים ודנדריט ההורה. ואילו האותות נטו להיות הגדול ביותר בעמוד השדרה הקרוב ביותר למקום משחררות הרפרוף, אמפליטודות בדנדריט ההורה וקוצים רחוקים היו עדיין די דומות לאלו בסביבה ישירה של נקודת משחררות הרפרוף. משחרר רפרוף בוצע עבור 300 אלפיות השניים שבמהלכה זרמים פנימה גדלו במשרעת. גלוטמט שברחה מכלוב ייתכן שמתפזר ברקמות במהלך אותה תקופת הזמן, הפעלה מרוחקת יותר ממקום משחררות הרפרוף ionotropic קולטני גלוטמט וזרם נתרן באזורים וקוצים הדנדריטים. בעיה מהותית שמתרחשת בעת שימוש בליזר UV לphotolysis של תרכובות כלוב מנוהלות באמצעות פתרון ים התאהוא &#39;סינון פנימי &quot;. בגלל קצב הספיגה הגבוה של הכלוב, אור UV מוחלש מאוד לאורך הדרך מהמטרה לאתר הגירוי 20,21. דרך אפשרית על מנת להימנע ממצב זה היא זלוף המקומי עם הכלוב, כי היא מוגבלת רק לאתר הגירוי, אשר יתר על כן מקטין את הכמות של תרכובת בכלוב זקוקה למינימום. בהשוואה למשחררות רפרוף בתיווך לייזר סריקת UV, שני פוטונים כמעט אינפרא אדום 22 משחררות רפרוף הוא מרחבית מדויקת יותר, בעיקר בגלל הדיוק של הגירוי מוגבר בציר z. מצד השני, בשל החתך הקטן של כלובים נפוצים לאורכי גל ארוכים יותר כפי שהיא מתבצעת עם שני פוטונים עירור, או ריכוז גבוה של המתחם בכלוב או גבוה מאוד, יש צורך בעוצמות אור פוטנציאל phototoxic. כמו כן, משחררות רפרוף שני פוטונים מחייבים השקעה גבוהה בהרבה בציוד; בין השאר, לייזר נוסף IR בתוספת הרכיבים האופטיים הנדרשים, יש צורך. SBFI ומשרד התשתיות הלאומי-גלוטמט שניהם להתרגש בטווח אורכי הגל הזהה. זה עלול להוביל לתלות הדדית לא מכוונת של לייזר UV משחררות רפרוף וSBFI או לייזר ההדמיה IR ומשרד התשתיות הלאומי, גלוטמט, וכתוצאה מכך הלבנת SBFI על ידי הבזק משחררות הרפרוף ו / או משחררות רפרוף רציפה של גלוטמט על ידי קרן IR. עם זאת, כפי שמוצג באיור 6 ג, לא פלאש UV על ידי עצמו ולא ההדמיה פוטון הרב נגרם שפעות גומלין כזה בתנאי הניסוי שלנו. מערכות UV-פלאש דומים לזה שתואר כאן משמשות באופן שיגרתי בהרבה מעבדות אחרות ויכולות בקלות יחסית להיות משולבת בתוך כל מיקרוסקופ הדמיה רב פוטון הקיים. הוא מציע יתרון שקרן הלייזר לphotolysis ניתן למקם באופן חופשי בשדה הראייה. בנוסף, המערכת מאפשרת מיקום מחדש מהיר ואוטומטי של קרן הלייזר ואת שחרורו נפח, בהתאמה, בשדה הראייה במהלך ניסוי. Ouשינוי r מפשט ומשפר את המיקום מדויק של נקודת משחררות הרפרוף, כך שהמסגרות של תוכנת ההדמיה יכולות לשמש כדי להתאים מסגרות הדמיה ומשחררות רפרוף congruently. יחדיו, כל תא תיקון מהדק והדמיה נתרן רב פוטון בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף UV-induced אור של גלוטמט, מאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. וכך זה יכול לשמש כדי לנתח את המאפיינים של שידור סינפטי מעורר ושל אותות נתרן postsynaptic בתאי עצב ברקמה שלמה.

שיפורים שנעשה לאחרונה בטכניקות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופיה רב הפוטון אפשרו המחקר של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, טכניקות אלה נמצאים כעת בשימוש נרחב כדי לנתח אותות הקשורים לפעילות חשמליות בתאי עצב, כמו גם אותות סידן במקביל בתאי subcellular קטנים, כלומר בדנדריטים קנס וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה, את המאפיינים שלו הם במידה רבה לא נחקרו. ניתן לנתח אותות אלה על ידי שני פוטונים הדמיה של נתרן תאיים ([Na +] i) המאפשרת המדידה של [Na +] אני ארעיים לתקופה ממושכת בלי הלבנת צבע משמעותית או צילום נזק 1,2 on-line. להדמיה של [Na +] i </תת&gt;, צבעי מחוון כימי רק כמה זמינים, למשל קורונה הירוקה לאסנטה נתרן הירוק 3,4. הבדיקה הניאון הנפוצה ביותר עבור Na + הדמיה היא isophthalate benzofuran (SBFI) מחייב נתרן. זה ratiometric, צבע UV-נרגש דומה לפורע-2 צבע סידן רגיש הידוע וכבר מועסק הדמיה Na + קונבנציונלית בסוגי תאים רבים (לדוגמא 5,6). ישנן אפשרויות שונות של מרגש הצבע ואיסוף הקרינה שלה. אם רזולוציה גבוהה זמנית (כלומר קצב פריימים גבוה הדמיה) נדרשת בשילוב עם מידע מרחבי, SBFI יכול להיות נרגש עם מנורת קשת קסנון או דיודה מכשיר בהספק גבוה פולטות אור (LED) ובפליטה שלה זוהתה עם תשלום במהירות גבוה מכשיר -coupled 7,8 (CCD) מצלמה. לרזולוציה מרחבית מקסימלי עמוקה ברקמה, מיקרוסקופיה סריקת לייזר רב פוטון היא שיטת הבחירה 9. Efficie הקוונטים הנמוך יחסיתncy של SBFI מחייב ריכוזים גבוהים יחסית צבע (0.5-2 מ&quot;מ), וטעינה ישירה של צורת קרום בלתי חדיר של SBFI באמצעות חדה פיפטה microelectrode 10 או תיקון 1. באמצעות SBFI, עבודה קודמת שבוצעה בחתכי רקמה חריפים של ההיפוקמפוס המכרסמים הראתה ארעיים נתרן הקשורים לפעילות בדנדריטים ועמוד שדרה של נוירונים הפירמידה CA1 שנגרמים בעיקר על ידי זרם של נתרן דרך ionotropic NMDA הקולטני 1,2. לצורך המחקר של המאפיינים של אותות נתרן מקומיים כגון בפירוט רב יותר, הפעלה ספציפית של קולטנים postsynaptic על ידי יישום של אגוניסטים לקולטן היא שיטה גם מתאימה-בחירה. כדי לחקות פעילות presynaptic ושחרור משדר, יישום צריך להיות קצר יחסית וממוקד כדי לאפשר גירוי מקומי. זה, עם זאת, מוכיח להיות די מאתגר ברקמה שלמה. יישום לחץ מקומי של אגוניסטים לקולטן באמצעות פיפטה דקה שקצהו מאפשר ap מאוד מוקדיקפול, אבל מארח את הסיכון הפוטנציאלי להפקת תנועה של המבנה של עניין (למשל כמו דנדריט או קוצים הדנדריטים), ובכך מעכב את ההדמיה ברזולוציה גבוהה. התאמתו של iontophoresis של חומרי נוירו פעיל תלויה בתכונות חשמליות שלהם ואמפליטודות נוכחית גבוהה עלולה לייצר חפצים סלולריים, כמו גם. אחת דרכים לעקוף מכשולים אלה היא התעסוקה של תרכובות המופעלת תמונה וphotolysis הבזק שלהם. בעיקרון, שני עקרונות שונים המשמשים לצילום הפעלה של חומרים בכלוב: I) רחב בתחום הבזק photolysis 11 וII) משחררות רפרוף מוקד העסקת מודולים סריקה בשילוב עם לייזרים 12. בעוד photolysis הבזק רחב בתחום משמש להפעלת אזורים גדולים יותר של עניין, למשל כל תא, משחררות רפרוף מוקד מועסק כדי לעורר באופן ספציפי תאים סלולריים קטנים. במחקר הנוכחי אנו מדגימים הליך לכל תא תיקון מהדק ורב-pההדמיה hoton נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב מרכזיים, בשילוב עם הליך הותאם למשחררות רפרוף מושרה UV-האור של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון אפשר הניתוח של פרמטרים מורפולוגיים ופיסיולוגיים של תאים במוח ברקמות שלמות עם החלטת מרחב ובזמן גבוהה. בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה, זה נעשה שימוש נרחב ללמוד אותות סידן הקשורים לפעילות בתאי subcellular קטנים כגון דנדריטים וקוצים הדנדריטים. בנוסף לארעיים סידן, פעילות הסינפטית גם גורמת אותות נתרן postsynaptic, את המאפיינים שלו הם הבינו רק באופן שולי. כאן, אנו מתארים שיטה לתיקון מהדק בשילוב כל תא והדמיה נתרן רב פוטון בתחומים מיקרו סלולריים של נוירונים מרכזיים. יתר על כן, אנו מציגים הליך הותאם לאולטרה סגול (UV) משחררות רפרוף מושרה -light של גלוטמט, המאפשר הפעלה אמינה ומוקד של קולטני גלוטמט ברקמה. לשם כך, כל תא הקלטות בוצעו ביחידת משנה Cornu Ammonis 1 (CA1) נוירונים פירמידה בחתכי רקמה חריפים שלההיפוקמפוס עכבר. נוירונים היו מלאים בSBFI צבע פלואורסצנטי נתרן רגיש באמצעות התיקון-פיפטה, ועירור רב פוטונים של SBFI אפשר להדמיה של דנדריטים וקוצים סמוכים. להקים משחררות רפרוף מוקד מושרה UV, מספר פרמטרים ובכלל זה עוצמת אור, עוצמת קול מושפע מקורה משחררות רפרוף UV, מיצוב של הקרן, כמו גם ריכוז של המתחם בכלוב נבדקו ומותאמים. התוצאות שלנו מראות כי זלוף המקומי עם גלוטמט בכלוב (משרד התשתיות הלאומי-גלוטמט) ותוצאת UV-משחררות רפרוף המוקד שלה בזרמים פנימה וארעיים נתרן בדנדריטים ועמוד שדרה. כמובן זמן והמשרעת של שני זרמים פנימה ואותות נתרן לתאם עם משך דופק משחררות הרפרוף. יתר על כן, התוצאות שלנו מראות כי אותות נתרן תאיים חסומים בנוכחות חוסמי לionotropic קולטני גלוטמט, הוכחה כי הם מתווכים על ידי זרם נתרן למרות שמסלול זה. לסיכום, השיטה שלנו מספקת כלי אמין לחקירה של אותות נתרן תאיים הנגרמים על ידי הפעלת קולט מוקדי ברקמת המוח שלמה.

במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים הליך למיקרוסקופיה רב פוטון של דינמיקת נתרן סלולרית עם SBFI צבע פלואורסצנטי נתרן תלוי בנוירונים הפירמידה CA1 של פרוסות רקמה בהיפוקמפוס עכבר חריף. יתר על כן, אנו מראים כיצד לשלב טכניקת הדמיה זו עם משחררות רפרוף מבוססות לייזר לסריקת של תרכובות נוירו פעיל (לדוגמא גלוטמט בכלוב) ו מדויק מיקוד למייקרו תחומים סלולריים. נוירונים טעינה עם SBFI באמצעות התיקון-פיפטה אפשרו להדמיה של כל התא כולל דנדריטים קנס וקוצים סמוכים על ידי העסקת עירור רב פוטונים (איור 6 א &#39;, ב&#39;, ד &#39;ואיור 7 א). <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6 אותות נתרן וזרמים סינפטיים הנגרמים על ידי הבזק photolysis של גלוטמט בכלוב. () מקסיםתמונת הקרנת אל של נוירון פירמידלי CA1 עמוס SBFI באמצעות פיפטה התיקון (PP). התיבה מציינת את האזור המוצג בהגדלת B. LP מציין את המיקום וכיוון של פיפטה לזלוף המקומי של גלוטמט בכלוב. הקרנת המרבית הספק גבוה של ערימה של חלקים אופטיים של דנדריט עם קוצים הדנדריטים סמוכים (B). הערימות של חלקים אופטיים עברו z-יישור וdeconvolution. הצלב האדום מציין את אזור היעד של קרן משחררות הרפרוף. הקו המקווקו הכתום משרטט את האזור של עניין שממנו פליטת הקרינה נרשמה. התיבה מציינת את האזור המוצג בהגדלת ד (ג) משמאל: אות נתרן (בשורה העליונה) וסומטי פנימה (בשורה תחתונה) נוכחית הנגרם על ידי הבזק photolysis של גלוטמט בכלוב (שצוין על ידי הבזק צהוב). הקו האדום מייצג את נתוני הניסוי בכושר. האזור האפור מייצג את התקופה שבה הבזק משחררות הרפרוף (300אלפיות שני) חסומים ההדמיה של הקרינה SBFI ימנית:. ללא מראש זלוף עם גלוטמט בכלוב, אותו UV-הבזק לא עוררו שינוי בפליטת SBFI, ולא זרם פנימה (ד &#39;) משמאל:. כוח תמונה גבוהה של דנדריט וסמוך קוצים כפי שמסומן בB. צד, את אותה תמונה עם ערכים אפורים הפוכים. קווים מקווקווים מציינים את האזורים של עניין שבו פליטת הקרינה נרשמה. הצלב האדום מציין את הלוקליזציה של קרן משחררות הרפרוף ימני:. ארעיים נתרן הנגרם על ידי UV-flash photolysis של גלוטמט בכלוב. עקבות כחולה: אותות נתרן בדנדריט; עקבות אדומות: ממוצע תגובה משלושה קוצים סמוכים למקום משחררות הרפרוף; עקבות ירוקות: ממוצע תגובה משלושה קוצים רחוקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לאחר זלוף המקומי עם כלובגלוטמט, החלת UV-הבזק קרוב לדנדריט הביאה לירידה זמנית בפליטת הקרינה של SBFI, המשקפת עלייה בריכוז הנתרן התוך התאי (איור 6 ג, ד ואיור 7). במקביל, זרם פנימה נרשם בסומה (איור 6C ואיור 7). הגדלת משך הזמן של פלאש UV הביאה הגדלת אמפליטודות של שני עוררו פנימה זרמים ואותות נתרן (מידע לא מוצג), מצביעה על כך שהמערכת הייתה גם בטווח הדינמי שלה וכי תגובות לא משחררות רפרוף ולא סלולריות היו רוויות. יישום של UV-flash של משך זהה או יותר לפרוסות אשר לא היה מראש perfused עם גלוטמט בכלוב, מעולם לא עורר שינויים בקרינת SBFI ולא זרמים פנימה, מצביע על כך שהאותות הללו הם תוצאה של משחררות הרפרוף של גלוטמט (איור 6 ג). יתר על כן, תוצאות אלו מראות כי אין תלות הדדית של מרכיבי imaging- ומשחררות רפרוף הוא ציינה under תנאי הניסוי שלנו. אותות נתרן גם ניתן היו לזהות בקוצים הדנדריטים (איור 6 ד). למרות שאנו לא ננסה להשיג גירוי של עמוד השדרה אחת בלבד עם משחררות רפרוף גלוטמט, אמפליטודות שיא נטו להיות מעט גבוה יותר בעמוד שדרה קרובה למקום משחררות הרפרוף, ואילו עמוד השדרה רחוקה הראתה כמעט זהים הקרינה שינויים כדנדריט ההורה (איור 6 ד). לבסוף, למדנו המסלול לזרם נתרן לתוך דנדריטים וקוצים בתגובה למשחררות רפרוף של גלוטמט. לשם כך, אנו מועסקים CNQX וAPV, אשר הם חוסמי בררניים לקולטניים גלוטמט נתרן חדיר, ionotropic של AMPA- וNMDA-תת סוג, בהתאמה. התוצאות שלנו מראות כי אותות נתרן תאיים הנגרם על ידי גלוטמט והזרמים סומטיים שהושרו הושמטו בנוכחות של חוסמי אלה (איור 7). על כביסה מהחוסמים, האותות חזרו. זה מדגים thaמשחררות רפרוף t של גלוטמט מפעיל קולטני גלוטמט ionotropic על נוירונים הפירמידה CA1, אשר מתווכים הזרם של נתרן לדנדריטים ועמוד שדרה, וכתוצאה מכך ארעיים נתרן תאיים וזרמים פנימה. <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> איור 7 פרופיל תרופתי של אותות נתרן עוררו וזרמים פנימה. נוירון פירמידלי CA1 מלא SBFI עם פיפטה התיקון (PP) (א) מצורף לסומה (ב &#39;) משמאל:. חולף נתרן ונוכחי סומטי הנגרם על ידי צילום הפעלה של גלוטמט בכלוב בדנדריט וקוצים מצורפים מרכז:. זלוף עם חוסמי הקולטן לגלוטמט ionotropic CNQX וAPV מעכבים שתי אות נתרן והזרם פנימה הנגרם על ידי משחרר רפרוף ימני:. עם כביסה מהחוסמים, האותות משוחזרים. Represen הקו האדוםts של נתונים הניסיוניים בכושר. האזור האפור מייצג את התקופה שבה הבזק משחררות הרפרוף (300 אלפיות השנייה) חסום ההדמיה של הקרינה SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

אנו מתארים את השילוב של תמונה-הפעלה מושרה UV מוקד של תרכובות נוירו פעיל עם כל תא תיקון מהדק והדמיה רב פוטון של עוברי נתרן תאיים בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב בהיפוקמפוס בחתכי רקמה חריפים של מוח העכבר.

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם מתח רגיש צבעים

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים<em&gt; In vivo</em&gt; עם<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

בשילוב optogenetic ולהקפיא-שבר Replica immunolabeling לבחינת הסדר ספציפי קלט של גלוטמט הקולטנים עכבר האמיגדלה

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...