Name: multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Alemã de Ciência (DFG, Ro2327 / 6-1) para CRR Os autores gostariam de agradecer a S. Durry e C. Rodrigo para assistência técnica especializada, e M. Dubbert (Laboratório de Eletrônica, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia, Alemanha) para obter ajuda na implementação do controlador de célula Pockels eo interruptor HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. 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Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. 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Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes. Os autores receberam apoio financeiro permitindo Open Publication Acesso por Rapp optoeletrônicos (Wedel, Alemanha), que produz um instrumento usado no artigo de vídeo. A empresa não foi nem envolvidos nos experimentos, nem na manipulação de dados, nem na escrita manuscrita.

O presente estudo mostra que SBFI é bem adequado para dois fótons de imagem de transientes de cálcio intracelular em pequenos compartimentos celulares. Tem que se ter em mente, porém, que a eficiência quântica de SBFI é bastante baixo em 15 e relativos alterações na concentração de sódio são muito pequenas com atividade fisiológica. Assim, a medição de alta resolução de transientes de Na + em processos distintos é uma tarefa relativamente tedioso, e criação de faixas ou a média de vários ensaios, pode ser necessário para obter sinais satisfatórios. Além disso, a cinética de transientes de sódio são surpreendentemente lenta, tornando obrigatória a gravar por períodos de tempo prolongados. Esta observação corresponde àqueles em estudos anteriores, onde decaimento monoexponencial de transientes de sódio em dendrites neuronais e em astrócitos foi caracterizado por grandes constantes de tempo de decaimento no intervalo de 10 segundos à temperatura ambiente, 1,2,6. Transientes de sódio, portanto, parecem exercer uma vez co muito mais lentourse e muito maiores constantes de tempo de decaimento, em comparação com transientes de cálcio 16. Separe essas desvantagens, a imagiologia de sódio revela-se uma ferramenta valiosa para a investigação das propriedades fisiológicas de subdomínios neuronais. Por exemplo, a imagiologia de sódio pode servir para acompanhar a actividade sináptica excitatória no ou perto de sinapses activas. Porque não é essencialmente sódio tamponada 8,17, transientes sódio induzido da actividade são linearmente relacionado com uma vasta gama de libertação sináptica de glutamato aplicado exogenamente ou glutamato. Eles, portanto, representam indicadores diretos e imparciais sobre a atividade glutamatérgica neuronal. Além disso, os corantes indicadoras de sódio apresentam uma elevada K d &#39;s (da SBFI K d está na gama de 25 a 1 mM). Mesmo com as concentrações relativamente elevadas de corante intracelulares utilizados para atingir o brilho suficiente (geralmente 0,5-1 mM), a alta K d &#39;s significa que os próprios corantes não actuar como tampões para sódio. Por conseguinte, eles não se distorcem o campo de amplitude nem o tempo de transientes de sódio, o que é sempre uma preocupação quando corantes sensíveis ao cálcio são introduzidos nas células 18. Assim, pode-se presumir que os sinais detectados representam uma boa medida das mudanças &quot;reais&quot; em sódio intracelular. Seu curso lento tempo implica, então, que a velocidade de difusão intracelular de sódio nos neurônios é muito menor do que anteriormente se pensava 19. Um requisito essencial para a execução bem sucedida de experimentos que abordam as propriedades excitatórias transmissão e influxo de sódio vias sinápticas em espinhas e dendritos é a indução de uma ativação rápida e altamente localizada de estruturas pós-sinápticos. Isto pode ser obtido por aplicação rápida e local de glutamato ou agonistas de glutamato na vizinhança directa de uma coluna ou um dendrito pelo fotólise de compostos em gaiolas. Flash fotólise faz dama não mecanicamentege o tecido, é livre de artefatos de movimento e está bem estabelecido para a investigação de questões relacionadas (por exemplo, a sinalização local de cálcio). O diâmetro da mancha de 1,5 um foi uncaging no plano xy. Uncaging perto de um sinal de sódio espinhoso dendrito induzida em ambas as espinhas e a dendrite pai. Considerando que os sinais tendem a ser maior nas espinhas mais próximas ao local uncaging, as amplitudes do dendrito pai e espinhas mais longe ainda eram bastante semelhantes aos imediações do local uncaging. Uncaging foi realizada durante 300 mseg, durante o qual as correntes internas aumento na amplitude. Glutamato Uncaged poderia ter difundido no tecido durante o mesmo período de tempo, ativando os receptores de glutamato ionotrópicos e influxo de sódio em regiões dendríticas e espinhas mais longe do local uncaging. Um problema intrínseco que ocorre quando se utiliza um laser de UV para a fotólise de compostos engaiolados administradas através da solução do banho de célulasé &quot;filtragem interior&quot;. Devido à elevada taxa de absorção da gaiola, a luz UV é atenuada fortemente ao longo do caminho do objectivo para o local de estimulação 20,21. Uma maneira possível de evitar isso é a perfusão local com a gaiola que está restrito apenas ao sítio de estimulação, o qual, além disso, diminui a quantidade de composto necessária para enjaulado um mínimo. Em comparação com uncaging UV a laser de varredura-mediada, quase-infra-vermelho de dois fotões uncaging 22 é espacialmente mais precisa, principalmente porque a exactidão da estimulação é aumentada no eixo z. Por outro lado, devido à pequena secção transversal de gaiolas vulgarmente utilizados para os comprimentos de onda mais longos, como empregues com excitação de dois fotões, ou uma elevada concentração do composto em gaiolas ou muito elevada, são necessárias intensidades de luz potencialmente fototóxicos. Além disso, dois fótons uncaging exige um investimento muito maior no equipamento; entre outros, um laser de IR adicional além dos componentes ópticos, é necessário,. Ambos SBFI e MNI-glutamato são excitáveis ​​na faixa de comprimento de onda idênticas. Isto pode levar a uma indesejada interdependência de laser de UV e uncaging SBFI ou laser imagem IR e MNI-glutamato, o que resulta no branqueamento de SBFI pelo flash uncaging e / ou um uncaging contínua de glutamato por o feixe de luz infravermelha. No entanto, como mostrado na Figura 6C, nem um flash UV, por si só, nem a imagem de vários fótons causado tais efeitos recíprocos, nas condições experimentais. Sistemas de flash de UV semelhantes ao descrito aqui são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios e outros podem ser relativamente facilmente incorporado em qualquer microscópio de imagem multi-fotão existente. Ele oferece a vantagem de que o feixe de laser para fotólise pode ser posicionado livremente no campo de visão. Além disso, o sistema permite um reposicionamento rápido e automático do feixe de laser e o volume de libertação, respectivamente, no campo de visão durante uma experiência. Our modificação simplifica e melhora o posicionamento preciso do local uncaging, de modo a que os quadros do software de imagem pode servir para ajustar quadros de imagem e uncaging congruentemente. Tomados em conjunto, de células inteiras de patch-clamp e imagem multi-fotão de sódio em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging luz UV-induzido de glutamato, permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Pode, assim, servem para analisar as propriedades de transmissão sináptica excitatória e de sinais de sódio em neurónios pós-sinápticos no tecido intacto.

As recentes melhorias nas técnicas de microscopia óptica, como a microscopia multi-fotão têm permitido o estudo de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, estas técnicas são agora amplamente utilizados para analisar os sinais elétricos relacionadas com a atividade dos neurônios, bem como sinais concomitantes de cálcio em pequenos compartimentos subcelulares, ou seja, em dendrites finas e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio em dendritos e espinhas, que possuem propriedades que são largamente inexplorado. Tais sinais podem ser analisados ​​por dois fotões imagiologia de sódio intracelular ([Na +] i) que permite a medição em linha de [Na +] i transitórios durante períodos prolongados sem branqueamento significativo corante ou foto-dano 1,2. Para imagiologia de [Na +] i </sub&gt;, apenas alguns corantes indicador químico estão disponíveis, por exemplo, Corona Verde ou Asante Natrium Verde 3,4. A sonda fluorescente mais usada para Na + imagem é isophthalate benzofuran- (SBFI) de ligação de sódio. É uma medida proporcional, corante UV-animado semelhante ao conhecido corante sensível ao cálcio com fura-2, e tem sido empregada para imagiologia convencional de Na +, em muitos tipos de células (por exemplo, 5,6). Existem diferentes possibilidades de excitar o corante e coleta de sua fluorescência. Se a alta resolução temporal (ou seja, uma taxa de quadros alta de imagem) é necessária em combinação com a informação espacial, SBFI pode ser animado com uma lâmpada xenon arco ou um dispositivo de alta potência diodo emissor de luz (LED) e sua emissão detectada com uma carga de alta velocidade dispositivo -coupled (CCD) 7,8. Para resolução espacial máxima profunda no tecido, microscopia de varredura a laser multi-fotão é o método de escolha 9. A relativamente baixa efficie quantumNCY de SBFI exige concentrações relativamente elevadas de corante (0,5-2 mM), e o carregamento directo de forma a membrana impermeável de SBFI através de um microeléctrodo afiada 10 ou remendo pipeta 1. Usando SBFI, trabalho anterior realizado em fatias de tecido agudas do hipocampo de roedores demonstraram transientes de sódio relacionadas com a actividade em dendritos e espinhas de neurônios piramidais CA1 que são causadas principalmente pelo influxo de sódio através ionotrópico receptores NMDA 1,2. Para o estudo das propriedades de tais sinais de sódio locais em mais detalhe, a activação específica de receptores pós-sinápticos, por aplicação de agonistas do receptor é um método bem adequada de escolha. Para imitar a atividade pré-sináptica e liberação do transmissor, a aplicação deve ser relativamente breve e focada para permitir estimulação local. Isto, no entanto, provou ser um grande desafio em tecido intacto. Aplicação de pressão local de agonistas do receptor utilizando uma pipeta de ponta fina permite ap muito focalcação, mas hospeda o risco potencial para a produção de movimento da estrutura de interesse (por exemplo, como um dendrito ou espinhas dendríticas), e, portanto, impede a imagem de alta resolução. A adequação da iontoforese de substâncias neuro-ativa depende de suas propriedades elétricas e altas amplitudes atuais podem produzir artefatos celulares também. Uma maneira de contornar esses obstáculos é o emprego de compostos fotoativados e sua fotólise. Basicamente, dois princípios diferentes são usados ​​para a foto-ativação de substâncias enjaulados: I) Wide-campo do flash fotólise 11 e II) uncaging focal empregando módulos de digitalização em combinação com lasers 12. Enquanto todo o campo de flash fotólise é utilizada para activar grandes regiões de interesse, por exemplo, uma célula inteira, uncaging focal é utilizado para estimular especificamente pequenos compartimentos celulares. No presente estudo, nós demonstramos um procedimento de célula inteira de patch-clamp e multi-pimagiologia de sódio Hoton em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging induzida por luz UV de glutamato, o que permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
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multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Microscopia de fluorescência multi-fotão permitiu a análise de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, é amplamente utilizada para estudar sinais de cálcio relacionadas com a actividade em pequenos compartimentos subcelulares, como dendritos e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio pós-sinápticos, as propriedades dos quais são compreendidos apenas marginalmente. Aqui, nós descrevemos um método para a célula inteira patch-clamp combinado e imagem de sódio multi-fotão em micro domínios celulares de neurônios centrais. Além disso, apresentamos um procedimento modificado de ultra-violeta (UV) uncaging -Light-induzida do glutamato, o que permite a ativação confiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Para este fim, as gravações de célula completa foram realizados em cornu Ammonis subdivisão 1 (CA1) neurónios piramidais em fatias de tecido aguda dahipocampo do rato. Os neurônios foram preenchidos com o corante fluorescente SBFI sensível ao sódio através do patch-pipeta, e multi-fotão excitação de SBFI permitiu a visualização dos dendritos e espinhas adjacentes. Para estabelecer uncaging focal induzida por UV, vários parâmetros, incluindo a intensidade da luz, o volume afectada pelo feixe uncaging UV, o posicionamento do feixe, bem como a concentração do composto testado foram engaiolados e optimizado. Nossos resultados mostram que a perfusão local com glutamato enjaulado (MNI-glutamato) e seu resultado UV-uncaging focal em correntes de entrada e transientes de sódio nos dendritos e espinhas. Curso de tempo e de amplitude dos dois sinais de correntes de entrada e de sódio correlacionar com a duração do impulso de uncaging. Além disso, os nossos resultados mostram que os sinais de cálcio intracelular são bloqueados na presença de agentes bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos, demonstrando que são mediados por influxo de sódio que esta via. Em resumo, o método fornece uma ferramenta fiável para oinvestigação dos sinais de sódio intracelular induzida por activação do receptor focal em tecido cerebral intacto.

No presente estudo, nós demonstramos um método de microscopia multi-fotão de dinâmica de sódio celulares com o corante fluorescente SBFI dependente de sódio em neurónios piramidais CA1 do rato aguda fatias de tecido de hipocampo. Além disso, mostramos como combinar esta técnica de imagem com uncaging baseada no escaneamento a laser de compostos neuro-ativo (por exemplo, o glutamato enjaulado) e seu direcionamento preciso para micro-domínios celulares. Carregando os neurónios com SBFI através da pipeta patch-activada a visualização de toda a célula, incluindo dendrites finas e espinhas adjacentes, empregando múltiplos fotões de excitação (Figura 6A, B, D e figura 7A). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 sinais de sódio e correntes sinápticas induzidas por fotólise de glutamato enjaulado. (A) Maximimagem de projeção al de um neurônio CA1 piramidal carregado com SBFI via pipeta de patch (PP). A caixa indica a área mostrada ampliada em B. LP indica a posição e orientação da pipeta para a perfusão local de glutamato enjaulado. (B) de projecção de alta potência máxima de uma pilha de secções ópticas de uma dendrite com espinhas dendriticas adjacentes. As pilhas de secções ópticas sofreu z-alinhamento e deconvolução. A cruz vermelha indica a região alvo do feixe uncaging. A linha pontilhada laranja delineia a região de interesse a partir do qual a emissão de fluorescência foi registada. A caixa indica a área mostrada ampliada em D. (C) Esquerda: sinal de sódio (linha superior) e somático interior atual (linha inferior) induzida por fotólise de glutamato enjaulado (indicado pelo flash amarelo). A linha vermelha representa um ajuste dos dados experimentais. A área cinzenta representa o período em que o flash uncaging (300ms) obstruiu a imagem de fluorescência SBFI Direito.: Sem pré-perfusão com glutamato enjaulado, o mesmo-flash UV nem provocou uma mudança na emissão SBFI, nem uma corrente para dentro (D) À esquerda:. Imagem de alta potência do dendrito e adjacente espinhas, conforme esboçado na B. Ao lado, a mesma imagem com valores de cinza invertidos. As linhas tracejadas indicam as regiões de interesse, em que a emissão de fluorescência foi registado. A cruz vermelha indica a localização do feixe uncaging direita:. Transientes sódio induzida por fotólise-lampejo de UV de glutamato enjaulado. Traço azul: sinais de sódio no dendrito; traço vermelho: resposta média de três espinhas adjacentes ao local uncaging; traço verde: resposta média de três espinhas distantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a> Após a perfusão local com Cagedglutamato, a aplicação de um flash de UV perto de uma dendrite resultou numa diminuição transitória na emissão de fluorescência de SBFI, reflectindo um aumento na concentração de cálcio intracelular (Figura 6C, D e Figura 7B). Ao mesmo tempo, uma corrente de influxo foi registada a soma (Figura 6C e a Figura 7B). Aumentando a duração do flash de UV resultou no aumento da amplitude de ambos os provocada correntes para dentro e os sinais de sódio (dados não mostrados), indicando que o sistema foi bem dentro da sua gama dinâmica e que as respostas celulares nem uncaging nem estavam saturados. Aplicação de um aparelho de lampejo de UV de duração idêntica ou mais fatias para que não havia sido pré-perfusão com glutamato enjaulado, nunca provocou alterações na fluorescência SBFI nem correntes de entrada, indicando que estes sinais são devido à uncaging de glutamato (Figura 6C). Além disso, estes resultados mostram que nenhum dos componentes interdependência imaging- e observa-se u uncagingnder nossas condições experimentais. Sinais de sódio também pode ser detectado nas espinhas dendríticas (Figura 6D). Enquanto nós não tentou realizar a estimulação de uma única coluna apenas com glutamato uncaging, amplitudes de pico tende a ser um pouco maior em lombadas próximas ao local uncaging, enquanto que as espinhas mais longe mostrou alterações de fluorescência praticamente idênticas às do dendrito pai (Figura 6D). Por fim, estudou-se o caminho para o influxo de sódio em dendritos e espinhas em resposta a uncaging de glutamato. Para este fim, utilizou-CNQX e APV, que são bloqueadores selectivos para os sódio-permeável, os receptores do glutamato ionotrópicos do AMPA- e subtipo NMDA-, respectivamente. Os nossos resultados mostram que os sinais de sódio intracelular induzida pelo glutamato e as correntes somáticas eliciados foram omitidos na presença destes bloqueadores (Figura 7B). Após a lavagem para fora dos bloqueadores, os sinais são recuperados. Isso demonstra that uncaging de glutamato ativa os receptores de glutamato ionotrópicos em neurônios piramidais CA1, que medeiam o influxo de sódio em dendritos e espinhas, resultando em transientes de cálcio intracelular ea correntes de entrada. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7 Perfil farmacológico de sinais de sódio evocadas e correntes de entrada. (A) cheio de SBFI CA1 piramidal neurônio com o patch pipeta (PP) ligado à soma (B) À esquerda:. Transitória de sódio e atual somática induzida por foto-ativação de glutamato enjaulado em um dendrito e espinhos anexados Center:. Perfusão com o Os bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos CNQX e APV inibe tanto o sinal de sódio e a corrente de influxo induzido por uncaging direita:. Ao wash-out dos bloqueadores, os sinais são restaurados. Os represen linha vermelhats um ajuste dos dados experimentais. A área cinza representa o período em que o flash uncaging (300 ms) obstruiu a imagem de SBFI fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

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