Name: multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом немецкого научного фонда (DFG, Ro2327 / 6-1), чтобы КПП Авторы выражают благодарность С. Durry и С. Родриго для экспертной технической помощи, и М. Dübbert (Electronics Laboratory, Зоологический институт , Кельнский университет, Германия) для помощи в осуществлении контроллер ячейки Поккельса и переключатель HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Авторы заявляют никакого конкурирующие интересы. Авторы получили финансовую поддержку благоприятных открытые публикации доступа по Рапп оптоэлектронные (Ведель, Германия), который производит прибор, используемый в видео статьи. Компания была ни участие в экспериментах, ни в обработке данных, ни в письменной форме рукописи.

Настоящее исследование показывает, что SBFI хорошо подходит для двухфотонного визуализации внутриклеточных переходных натрия в малых сотовых отсеков. Следует иметь в виду, однако, что квантовая эффективность SBFI довольно низкие 15 и относительные изменения концентрации натрия довольно небольшие с физиологической активности. Таким образом, с высоким разрешением измерение Na + переходных процессов в тонких процессов является относительно трудоемкой задачей, и биннинг или усреднение нескольких испытаний необходимо получить удовлетворительные сигналы. Кроме того, кинетика переходных натрия удивительно медленно, что делает его обязательным для записи в течение длительных периодов времени. Это наблюдение соответствует тем в более ранних исследований, в которых моноэкспоненциален распад переходных натрия в нейрональных дендритов и в астроциты были характерны большие постоянные времени затухания в диапазоне от 10 сек при комнатной температуре в 1,2,6. Переходные натрия, таким образом, кажется, оказывают гораздо медленнее времени сотрудничестваUrse и гораздо более крупные временные распада константы как по сравнению с кальция переходных 16. Отложите эти недостатки, изображений натрия оказывается ценным инструментом для исследования физиологических свойств нейронов поддоменов. Например, изображения натрия может служить для контроля возбуждающую синаптическую активность на уровне или близко к активных синапсов. Поскольку натрия, по существу, не сохраняются в буфере 8,17, активность индуцированной переходные натрия линейно связаны с широким диапазоном синаптической выпуска глутамата или экзогенно применяются глутамата. Они, следовательно, представляют собой прямые, беспристрастные показатели нейронов глутаматергической деятельности. Кроме того, индикатор натрия красители обладают высокой Уб &#39;ы (SBFI в Уб находится в диапазоне от 25 мм 1). Даже при относительно высоких концентрациях внутриклеточных красителей, используемых для достижения достаточной яркости (обычно 0,5 - 1 мм), высокой Уб &#39;ы подразумевает, что сами красители не действуют в качестве буферов для сOdium. Следовательно, они не искажают амплитуду, ни временной ход переходных натрия, который всегда является проблемой, когда кальция чувствительных красителей вводят в клетки 18. Таким образом, можно предположить, что обнаруженные сигналы представляют собой хорошую меру &quot;реальных&quot; изменения внутриклеточного натрия. Их медленное время, конечно, то означает, что скорость диффузии для внутриклеточного для натрия в нейронах значительно меньше, чем предполагалось ранее 19. Важным условием для успешного проведения экспериментов, касающихся свойств возбуждающих синаптических передачи и притока натрия путей в колючки и дендритов является индукция быстрого и высоко локализованной активации постсинаптических структур. Это может быть получено быстро и местного применения глутамата или глутамата агонистов в непосредственной близости от позвоночника или дендритов по флэш-фотолиза клетке соединений. Импульсный фотолиз не механически DamaGE ткани, свободен от артефактов движения и хорошо известна за расследование связанных с этим вопросов (например, местную сигнализацию кальция). Диаметр uncaging месте был 1,5 мкм в плоскости ху. Uncaging близко к колючий дендритов индуцированных сигналов натрия в обоих шипами и родитель дендритов. В то время как сигналы, как правило, по величине в шипов, ближайших к месту uncaging, амплитуды в родительском дендрита и шипы еще дальше по-прежнему довольно близки к тем, в непосредственной близости от uncaging месте. Uncaging проводили в течение 300 мсек, в течение которого внутренние токи увеличению амплитуды. Uncaged глутамат, возможно, рассеянный в ткани в течение того же периода времени, активации ионотропных рецепторы глутамата и приток натрия на дендритных регионов и шипами дальше от uncaging месте. Внутренняя проблема, которая возникает при использовании УФ лазер для фотолиза в клетке соединений, вводимых через клеточную растворе ванныявляется «внутренняя фильтрация». В связи с высокой скоростью поглощения клеткой, УФ-излучение ослабляется сильно по пути от объектива к стимуляции сайте 20,21. Еще один вероятный способ избежать этого является локальной перфузии с клеткой, ограниченной только на сайте стимуляции, которая, кроме того, уменьшается количество клетке соединения, необходимая к минимуму. По сравнению с УФ лазерного сканирования опосредованного uncaging, почти инфракрасного двухфотонного uncaging 22 пространственно точнее, в основном потому, что точность стимуляции увеличивается в оси. С другой стороны, в связи с небольшим поперечным сечением, обычно используемых клетках в течение более длинных волн, как работающих с двухфотонном возбуждении, либо высокая концентрация соединения в клетке или очень высокой, потенциально фототоксические интенсивности света необходимы. Кроме того, двухфотонная uncaging требует гораздо выше инвестиции в оборудование; среди прочего, дополнительный ИК лазер плюс обязательные оптические компоненты, необходимы. Оба SBFI и MNI-глутамата в возбудимых в одинаковом диапазоне длин волн. Это может привести к непреднамеренной взаимозависимости УФ uncaging лазера и SBFI или лазера ИК изображений и MNI-глутамата, в результате отбеливания SBFI по uncaging вспышкой и / или непрерывном uncaging глутамата по ИК-луча. Однако, как показано на рисунке 6С, ни УФ вспышка сама по себе, ни мульти визуализации фотонов не вызвал таких взаимные эффекты в условиях нашего эксперимента. УФ-флеш систем, подобные описанному здесь обычно используются во многих других лабораториях и может относительно легко быть включены в любой существующий мульти-Фотон изображений микроскопом. Это дает то преимущество, что лазерный луч для фотолиза может быть размещен свободно в поле зрения. Кроме того, система обеспечивает быстрый и автоматизированный изменение положения лазерного луча и объем выпуска, соответственно, в поле зрения во время эксперимента. OuR модификации упрощает и улучшает точность позиционирования uncaging месте, так, чтобы рамы обработки изображений может служить для регулировки изображений и uncaging кадров конгруэнтно. Взятые вместе, цельноклеточная патч-зажим и визуализации многофотонной натрия в дендритов и шипов центральных нейронов, в сочетании с модифицированной процедуры для УФ-света, вызванного uncaging глутамата, позволяет надежно и фокусное активации глутаматных рецепторов в ткани. Он может, таким образом, служат для анализа свойств возбуждающей синаптической передачи и постсинаптических сигналов натрия в нейронах в неповрежденной ткани.

Последние достижения в световой микроскопии методов, таких как многофотонной микроскопии позволили изучение морфологических и физиологических параметров клеток мозга в неповрежденной ткани с высоким пространственным и временным разрешением. В сочетании с электрофизиологии, эти методы в настоящее время широко используется для анализа деятельности, связанных электрических сигналов в нейронах, а также сопутствующих сигналов кальция в небольших субклеточных отсеков, а именно в мелких дендритов и дендритных шипиков. В дополнение к переходных кальция, синаптической активности также индуцирует сигналы натрия в дендритов и шипами, свойства которых в значительной степени неисследованными. Такие сигналы могут быть проанализированы двухфотонного визуализации внутриклеточного натрия ([Na +] I), который позволяет он-лайн измерение [Na +] Я переходных для длительных периодов времени без заметного обесцвечивания красителя или фото-повреждения 1,2. Для визуализации [Na +] Я </суб&gt;, только несколько красители химического индикатора доступны, например, короны Зеленый или Asante Натрий Зеленый 3,4. Наиболее часто используется флуоресцентного зонда для визуализации Na + является натрий-связывающий бензофурана изофталата (SBFI). Это ратиометрический, УФ-возбужденных краситель аналогично известному кальций-чувствительного красителя фура-2 и был использован для обычного изображения Na + во многих типах клеток (например, 5,6). Существуют различные возможности возбуждения красителя и сбора его флуоресценции. Если высоким временным разрешением (т.е. частота кадров высокой томография) требуется в сочетании с пространственной информацией, SBFI могут возбуждаться с ксеноновой дуговой лампы или высокой мощности светодиодной (LED) устройства и его излучения обнаруженного с высокой скоростью заряда -coupled (ПЗС) камеры 7,8. Для максимального пространственного разрешения глубоко в ткани, многофотонное лазерная сканирующая микроскопия является методом выбора 9. Относительно низкий квантовый efficieNCY из SBFI требует относительно высокие концентрации красителя (0,5 - 2 мм) и прямую загрузку с мембраной непроницаемой виде SBFI через резкого микроэлектрода 10 или патч-пипетки 1. Использование SBFI, ранее выполненные работы в острых кусочков ткани грызунов гиппокампа показали деятельностных переходные натрия в дендритов и шипами CA1 пирамидальных нейронов, которые в основном вызванные притоком натрия через ионотропного NMDA рецепторов 1,2. Для изучения свойств таких местных сигналов натрия более подробно, удельная активация постсинаптических рецепторов путем применения агонистов рецептора представляет собой хорошо подходит метод выбора. Чтобы имитировать пресинаптическое активность и выделения медиатора, приложение должно быть относительно коротким и сосредоточены для разрешения локальных стимуляции. Это, однако, оказывается довольно сложной задачей в интактной ткани. Приложение Часовой давление агонистов рецептора с помощью пипетки с острым концом позволяет очень фокусное арпликация, но проходит потенциальный риск для получения движение структуре интерес (например, таких, как дендрита или дендритных шипов), и, таким образом, препятствует высокого разрешения изображений. Пригодность ионофореза нейро-активных веществ зависит от их электрических свойств и высокие амплитуды тока может производить сотовые артефакты, а также. Один из способов обойти эти препятствия является применение фото-активированный соединений и их импульсного фотолиза. В принципе, два разных принципы используются для фото-активации в клетке веществ: I) Широкий поля импульсного фотолиза 11 и II) фокусное uncaging использованием модулей сканирования с лазерами на 12. Хотя широкого поля импульсного фотолиза используется для активации большие области, представляющие интерес, например, целая клетка, фокусное uncaging используется для специально стимулировать небольшие клеточные отсеков. В настоящем исследовании мы демонстрируем порядок цельноклеточная патч-зажим и мульти-рHoton изображений натрия в дендритов и шипов центральных нейронов, в сочетании с модифицированной процедуры для УФ-света, вызванного uncaging глутамата, который позволяет надежно и фокусное активации глутаматных рецепторов в ткани.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Многофотонная флуоресцентной микроскопии позволило анализ морфологических и физиологических параметров клеток мозга в неповрежденной ткани с высоким пространственным и временным разрешением. В сочетании с электрофизиологии, он широко используется для изучения деятельностных сигналы кальция в небольших субклеточных отсеков, таких как дендритов и дендритных шипиков. В дополнение к переходных кальция, синаптической активности также вызывает постсинаптические сигналы натрия, свойства которых лишь незначительно понятны. Здесь мы опишем метод комбинированного цельноклеточная патч-зажим и визуализации многофотонной натрия в клеточных микро областях центральных нейронов. Кроме того, мы вводим модифицированный порядок ультрафиолетового (УФ) -light вызванной uncaging глутамата, что позволяет надежную и фокусное активацию рецепторов глутамата в тканях. С этой целью, цельноклеточные записи проводились на Корню Ammonis подразделения 1 (АК1) пирамидальных нейронов в острых кусочков тканигиппокамп мыши. Нейроны были наполнены SBFI флуоресцентным красителем натрия чувствительных через патч-пипетки, и многофотонное возбуждение SBFI включен визуализации дендритов и смежных шипами. Чтобы установить УФ-индуцированного фокусное uncaging, несколько параметров в том числе интенсивности света, объема, пострадавших от УФ uncaging луча, положения пучка, а также концентрации в клетке соединения были испытаны и оптимизированы. Наши результаты показывают, что местное кровоснабжение с клетке глутамата (MNI-глутамат) и его фокусное УФ-uncaging результат в внутрь токов и переходных натрия в дендритов и шипами. Время, конечно, и амплитуда токов как вовнутрь, так и сигналов натрия коррелирует с длительностью импульса uncaging. Кроме того, наши результаты показывают, что внутриклеточные сигналы, натриевые заблокированы в присутствии блокаторов для ионотропных глутаматных рецепторов, демонстрируя, что они опосредованы притока натрия, хотя этого пути. Таким образом, наш метод обеспечивает надежный инструмент дляИсследование внутриклеточных сигналов натрия, вызванных активацией рецептора фокальной в интактной ткани головного мозга.

В настоящем исследовании мы демонстрируем порядок многофотонной микроскопии динамики клеточных натрия с SBFI флуоресцентного красителя натрий-зависимого в CA1 пирамидальных нейронов острый мыши ломтиками ткани гиппокампа. Кроме того, мы покажем, как объединить эту технику визуализации с лазерного сканирования на основе uncaging нейро-активных соединений (например, в клетке глутамата) и его точного наведения на сотовые микро-доменов. Загрузка нейроны с SBFI через патч-пипетки включен визуализацию всей клетки в том числе мелких дендритов и смежных шипов за счет использования возбуждения многофотонной (фиг.6А, В, D и 7А). <img alt="Рисунок 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Рисунок 6 сигналы натрия и синаптические токи, индуцированные импульсном фотолизе клетке глутамата. () Максималь проекция образ CA1 пирамидальных нейронов загруженной с SBFI через патч пипетки (PP). Коробка показывает область показано в увеличенном виде Б. LP указывает на положение и ориентацию пипетки для местного перфузии в клетке глутамата. (Б) высокой мощности максимальный выступ стопку оптических секций дендрита с соседними дендритных шипов. Стопки оптических секций прошли Z-выравнивание и деконволюции. Красный крестик указывает целевую область uncaging луча. Оранжевый пунктирная линия очерчивает область интереса, из которого флуоресценции был записан. Коробка показывает область показан в увеличенном Д. (С) слева: натрия сигнал (верхний ряд) и соматических внутреннюю тока (нижний ряд), вызванное импульсном фотолизе клетке глутамата (обозначается желтой вспышкой). Красная линия представляет собой подгонку экспериментальных данных. Серая зона представляет собой период, в котором uncaging вспышки (300мсек) не препятствовали визуализации флуоресценции SBFI Справа:. Без предварительной перфузии клетке глутамата, то же самое УФ-вспышки ни вызывали изменения в эмиссии SBFI, ни входящего тока (D) Слева:. Высокая мощность образ дендрита и рядом шипы, как это описано в B. Вместе с тем, тот же образ с перевернутыми значений серого. Пунктирные линии указывают регионы интерес, в котором излучение флуоресценции записанные. Красный крест указывает на локализацию uncaging луча Справа:. Натрий переходные, вызванные УФ-импульсном фотолизе клетке глутамата. Синий след: натриевые сигналы в дендритов; красный след: в среднем отклик от трех шипов, прилегающих к uncaging месте; зеленый след: в среднем отклик от трех дальних шипами. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">для более полной версии этой фигуры Пожалуйста, нажмите здесь.</a> После местной перфузии с клеткамиглутамат, применяя УФ-вспышку близко к дендрита привело к уменьшению переходного флуоресцентное излучение SBFI, что отражает увеличение внутриклеточной концентрации натрия (фиг.6С, D и 7В). В то же время, внутрь ток был записан в сомы (фиг.6С и 7В). Увеличение длительности вспышки УФ привело к увеличению амплитуды и вызвала внутрь токов и сигналов натрия (данные не приведены), что указывает, что система была в пределах его динамическом диапазоне, и что ни один, ни uncaging клеточные ответы были насыщены. Применение УФ-вспышкой, идентичной или более длительный срок, чтобы кусочки, которые не были предварительно перфузию клетке глутамата, не вызывал изменений в SBFI флуоресценции ни внутрь токов, что указывает, что эти сигналы обусловлены uncaging глутамата (фиг.6С). Кроме того, эти результаты показывают, что ни взаимозависимость imaging- и uncaging компонентов не наблюдается UNDER наших экспериментальных условиях. Сигналы натрия может быть также обнаружен в дендритных шипов (Рисунок 6d). В то время как мы не пытались добиться стимуляции одной позвоночника только с глутаматом uncaging, пиковые амплитуды имели тенденцию быть немного выше, в колючки, близких к uncaging месте, в то время как шипы дальше показали практически идентичные изменения флуоресценции, как и родительский дендритов (Рисунок 6D). Наконец, мы изучили путь для притока натрия в дендритов и шипами в ответ на uncaging глутамата. Для этого мы использовали CNQX и APV, которые являются селективными блокаторами для натрий-проницаемой, ионотропных глутамата рецепторы AMPA- и NMDA-подтипа, соответственно. Наши результаты показывают, что глутамат-индуцированный сигналов внутриклеточного натрия и вызвал соматические токи были опущены в присутствии этих блокаторы (фиг.7В). После вымывания из блокаторов, сигналы восстановили. Это показывает, тхат uncaging глутамата активизирует ионотропных рецепторы глутамата на СА1 пирамидальных нейронов, которые опосредуют приток натрия в дендритов и шипами, в результате внутриклеточных переходных натрия и внутрь токов. <img alt="Рисунок 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Рисунок 7 Фармакологический профиль вызванных сигналов натрия и внутрь токов. () SBFI заполненные CA1 пирамидальных нейронов с патч пипетки (ПП), который прилагается к сомы (B) Слева:. Натрия переходный и соматической ток, индуцированный фото-активации в клетке глутамата в дендрита и прикрепленные шипы Центр:. Перфузии с блокаторы глутаматных рецепторов ионотропные CNQX и APV ингибирует как сигнал натрия и внутреннюю ток, индуцированный uncaging Справа:. После вымывания из блокаторов, сигналы будут восстановлены. Красные представи линиитс приступ экспериментальных данных. Серая зона представляет собой период, в котором uncaging флэш (300 мс) препятствовали визуализации флуоресценции SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">для более полной версии этой фигуры Пожалуйста, нажмите здесь.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons at JoVE.com

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Мы описания комбинации фокусным ультрафиолетовым излучением фото-активации нейро-активных соединений с цельноклеточной патч-зажим и мульти-Фотон изображений внутриклеточных переходных натрия в дендритов и шипиков нейронов гиппокампа в острых кусочков ткани мозга мыши.

Многофотонная внутриклеточного натрия изображений сочетании с УФ-опосредованного Focal Uncaging глутамата в СА1 пирамидальных нейронов

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Оптических изображений нейронов в Крабовидной стоматогастральных ганглия с напряжением чувствительных красителей

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Метод высокой верности Optogenetic управление отдельными пирамидальных нейронов<em&gt; В естественных условиях</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

Внутриклеточной регистрации, Сенсорная поле карт, а также культивирование Выявленные Нейроны в Лича, Hirudo MEDICINALIS</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Функциональная Допрос взрослых гипоталамуса нейрогенеза с Focal радиологической ингибирования

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Обонятельных нейронов, полученных с помощью носовой биопсии в сочетании с лазерной съемки микродиссекции: возможный подход к исследуемым препаратом ответ психических расстройств

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D изображений и анализ нейронов Infected<em&gt; В Vivo</em&gt; С<em&gt; Токсоплазма</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Комбинированный оптогенетика и сублимационной перелом реплики иммунноокрашивания по анализу Устройство ввода специфических рецепторов глутамата у мышей Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric кальция изображений отдельных нейронов в себя Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

В естественных условиях Двух фотонных изображений корковых нейронов в новорожденных мышей

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...