Name: expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes
Uploaded: 2015-01-12T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes at JoVE.com

De auteurs willen graag de steun van de &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; te erkennen voor de veehouderij. Dit werk werd ondersteund door fondsen van ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 en ANR-11-JSV2-002-01) aan Michael Schubert, door de Europese Unie KP6 subsidie ​​&quot;Embryomics&quot; en door de ANR subsidie ​​&quot;ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-proces &quot;aan Jean-François Nicolas en Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho wordt gefinancierd door een FCT doctoraatsbeurs (SFRH / BD / 86878/2012). Verzoeken om de hier beschreven vectoren kunnen rechtstreeks worden gericht aan de auteurs.

1. Voorbereiding van de instrumenten en reagentia <ol style="margin-left: 40px;"><li> Transfer pasteurpipetten <ol><li> Genereren van een reeks van overdracht pasteurpipetten met verschillende diameters tip door te trekken 230 mm lang pasteurpipetten boven een vlam bij verschillende snelheden. Zorg ervoor dat de tapsheid zo lang mogelijk voor vloeiende en nauwkeurige regeling aspiratie. </li><li> Met een diamant schrijver, krassen pipet langs een lijn loodrecht op de lengterichting van de pipet. Met beide handen, trek...

<ol>
	<li>Weber, T., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+tools+for+multicolor+imaging+in+zebrafish+larvae.">Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae.</a> Methods. 62, 279-291 (2013).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+as+a+tool+of+mechanical+delivery.">Microinjection as a tool of mechanical delivery.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).</li><li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes.">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> J. Vis. Exp. , e50841 (2014).</li><li>Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+and+tunicates+as+evolutionary+model+systems.">Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).</li><li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+amphioxus.">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li><li>Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+new+characters+after+whole+genome+duplications:+insights+from+amphioxus.">Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).</li><li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+the+tunicates.">Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates.</a> Development. 138, 2143-2152 (2011).</li><li>Yu, J. K., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordates+(amphioxus+or+lancelets):+a+model+for+understanding+the+evolution+of+chordate+characters.">Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Fuentes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+spawning+behavior+and+development+of+the+European+amphioxus+(Branchiostoma+lanceolatum).">Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum).</a> J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).</li><li>Li, G., Shu, Z., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Year-round+reproduction+and+induced+spawning+of+Chinese+amphioxus,+Branchiostoma+belcheri,+in+laboratory.">Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory.</a> PLoS One. 8, e75461 (2013).</li><li>Theodosiou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+spawning+behavior+in+an+artificial+seawater+facility.">Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility.</a> J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).</li><li>Holland, L. Z., Yu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordate+(amphioxus)+embryos:+procurement,+culture,+and+basic+methods.">Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods.</a> Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).</li><li>Holland, L. Z., Onai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+gene+function+in+amphioxus+embryos+by+microinjection+of+mRNAs+and+morpholino+oligonucleotides.">Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides.</a> Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).</li><li>Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+microinjection+method+for+unfertilized+eggs+of+Asian+amphioxus+Branchiostoma+belcheri.">An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri.</a> Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).</li><li>Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-targeted+green+fluorescent+protein+reliably+and+uniquely+marks+cells+through+apoptotic+death.">Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death.</a> Cytometry. 43, 273-278 (2001).</li><li>Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+nuclei+in+Aspergillus+oryzae+with+EGFP+and+analysis+of+the+number+of+nuclei+in+each+conidium+by+FACS.">Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).</li><li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD.">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li><li>Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+preferred+nucleotide+sequences+around+the+translation+initiation+codon+in+eukaryote+genomes.">Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).</li><li>Deheyn, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+green+fluorescent+protein+(GFP)+in+amphioxus.">Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus.</a> Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).</li><li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+acts+via+Hox1+to+establish+the+posterior+limit+of+the+pharynx+in+the+chordate+amphioxus.">Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus.</a> Development. 132, 61-73 (2005).</li><li>Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

In dit artikel presenteren we voor het eerst een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor de injectie van B. lanceolatum eicellen die na B. Floridae 13,14 en B. belcheri 15, dus de derde amphioxus soorten waarvan dergelijke techniek is beschreven. Belangrijk is het protocol beschreven hier ook de beschrijving van vectorsystemen geschikt voor de productie van proteïnen B. lanceolatum van geïnjecteerde mRNA geproduceerd in vitro (hieronder beschre...

Tijdens de ontwikkeling van een enkele cel leidt tot een volledig organisme in een zeer complex proces dat zowel celdelingen en bewegingen omvat. Om beter te begrijpen van de biologische principes van de dynamiek van de cel gedrag, hebben ontwikkelingsbiologen begonnen met fluorescentie gebaseerde in vivo imaging technieken te gebruiken. Specifieke compartimenten van cellen, zoals celmembranen, kan hetzij door behandelingen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen, een benadering gehinderd door een gebrek aan specificiteit en weefselpenetratie 1 of de specifieke introductie in het embryo van exogeen mRNA coderend fluorescente proteïnen 2. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt voor de efficiënte afgifte van exogene verbindingen, zoals mRNA. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, micro-injectie, elektroporatie, beschieting met microdeeltjes, lipofectie en transductie 3,4. Hoewel al deze benaderingen kan worden gebruikt om exogene verbindingen in een ingevoerdontwikkeling van het embryo, alleen micro-injectie kan de toepassing van vooraf gedefinieerde en precieze hoeveelheden in elke cel 3. Micro-injectie technieken zijn beschreven voor alle belangrijke ontwikkelings modelsystemen 4 (bijvoorbeeld, fruitvliegen, nematode wormen, zebravis, kikkers, muizen) en voor sommige alternatieve modellen 4, onder andere gebruikt voor vergelijkende studies gericht op het begrijpen van de evolutie van ontwikkelingsmechanismen (bv, zeeanemonen, annelid wormen, zee-egels, ascidian manteldieren, de Schedellozen amphioxus). Cephalochordates, die samen met manteldieren en gewervelden vestigen de chordate phylum, zijn bijzonder goed geschikt modellen om de evolutie van chordadieren en de diversificatie van de gewervelde dieren van een ongewerveld voorouder 5-8 te bestuderen. De Schedellozen lineage afweken zeer vroeg tijdens chordate evolutie; en bestaande cephalochordates, die zijn onderverdeeld in drie geslachten (Branchiostoma, Asymmetron en Epigonichthys), lijken op gewervelde dieren, zowel in termen van algemene anatomie en genoom architectuur 5-8. Van de ongeveer 30 soorten cephalochordates die tot nu toe zijn beschreven, vijf zijn beschikbaar voor embryologische en ontwikkelingsstudies 6,9: Asymmetron lucayanum (de Bahama lancetvisje), Branchiostoma Floridae (de amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (de Europese amphioxus), Branchiostoma belcheri (de Chinese amphioxus) en Branchiostoma japonicum (de Japanse amphioxus). Rijpe volwassenen van drie van deze soorten (B. lanceolatum, B. belcheri en B. japonicum) kan worden geïnduceerd om te paaien on-demand tijdens het broedseizoen 10,11. Bovendien, althans voor B. lanceolatum kan een efficiënt paai ook geïnduceerd worden in kunstmatig zeewater 12, waardoor deze bijzondere Schedellozen soort toegankelijk voor laborator makenies die geen toegang tot natuurlijke zeewater hebben. De combinatie, in B. lanceolatum van een gemakkelijke en betrouwbare toegang tot embryo&#39;s met een efficiënte levering methode, zoals micro-injectie, tot nu toe de enige afgiftetechniek ontwikkeld amphioxus (zowel B. Floridae en B. belcheri) 13-15, zal de ontwikkeling van een mogelijk roman suite van manipulatieve technieken, waaronder lineage opsporings- en dynamische cel-gedrag-gebaseerde benaderingen. Een protocol voor de efficiënte micro-injectie van mRNA naar fluorescerende eiwitten in de B. uitdrukken lanceolatum embryo werd dus ontwikkeld. Bovendien, om een basis toolkit voor live beeldvorming van B. bieden lanceolatum embryo, vector systemen ontwikkeld die membraangebonden en nucleaire expressie van fluorescerende eiwitten mogelijk. Voor membraan targeting, versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) werd gefuseerd met de humane HRAS CAAX box en nucleaire lokalisatie van mCherry en eGFP wasverkregen door fusie aan de zebravis histon 2B (H2B) exon (figuur 1, aanvullend bestand 1). Verder met als doel eiwittranslatie optimaliseren, de Kozak sequenties en codons van de constructen werden aangepast en afgestemd op gebruik in B. lanceolatum. Samen zullen de injectiemethode en expressievectoren hier gepresenteerde dienen als basis voor het genereren van nieuwe experimentele benaderingen voor cephalochordates name analyses met de nieuwste fluorescentie gebaseerde in vivo beeldvorming.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Het protocol hierboven beschreven verschaft de basis voor de micro-injectie van B. lanceolatum eicellen en dus ook voor het binnenbrengen in het ontwikkelen van B. lanceolatum embryo van mRNA coderend fluorescerende eiwitten in vivo beeldvorming. Hoewel de techniek zeker robuust en betrouwbaar, het percentage succesvolle injecties met dit protocol uiteenloopt (tabel 1). De zeer waarschijnlijke verklaring voor deze intrigerende feite de extreme variabiliteit van eicel koppeling...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes at JoVE.com

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Enten van kralen in de ontwikkeling van kippenembryo Ledematen kunnen identificeren signaaltransductieroutes invloed Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Inductie van Acute Skeletal Muscle Regeneration door cardiotoxine Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in ovariële follikels van zebravissen

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...