Name: expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes
Uploaded: 2015-01-12T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר את התמיכה על ידי &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-איווט&quot; לגידול בעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מANR (ANR-09-BLAN-0262-02 וANR-11-JSV2-002-01) למייקל שוברט, על ידי המענק של האיחוד האירופי FP6 &quot;Embryomics&quot; ועל ידי מענק ANR &quot;ANR- 10-BLAN-121,801 Dev-תהליך &quot;לז&#39;אן-פרנסואה ניקולא ונדין Peyriéras. João עמנואל Carvalho ממומן על ידי מענק דוקטורט FCT (SFRH / BD / 86878/2012). בקשות לווקטורים שתוארו כאן ניתן לפנות ישירות למחברים.

1. הכנה של מכשירים וריאגנטים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את טפטפות פסטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור סדרה של טפטפות פסטר העברה בקטרים ​​קצה שונים על ידי משיכת pipettes פסטר הארוך 230 מ&quot;מ מעל להבה במהירויות שונ?...

<ol>
	<li>Weber, T., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+tools+for+multicolor+imaging+in+zebrafish+larvae.">Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae.</a> Methods. 62, 279-291 (2013).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+as+a+tool+of+mechanical+delivery.">Microinjection as a tool of mechanical delivery.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).</li><li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes.">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> J. Vis. Exp. , e50841 (2014).</li><li>Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+and+tunicates+as+evolutionary+model+systems.">Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).</li><li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+amphioxus.">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li><li>Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+new+characters+after+whole+genome+duplications:+insights+from+amphioxus.">Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).</li><li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+the+tunicates.">Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates.</a> Development. 138, 2143-2152 (2011).</li><li>Yu, J. K., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordates+(amphioxus+or+lancelets):+a+model+for+understanding+the+evolution+of+chordate+characters.">Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Fuentes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+spawning+behavior+and+development+of+the+European+amphioxus+(Branchiostoma+lanceolatum).">Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum).</a> J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).</li><li>Li, G., Shu, Z., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Year-round+reproduction+and+induced+spawning+of+Chinese+amphioxus,+Branchiostoma+belcheri,+in+laboratory.">Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory.</a> PLoS One. 8, e75461 (2013).</li><li>Theodosiou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+spawning+behavior+in+an+artificial+seawater+facility.">Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility.</a> J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).</li><li>Holland, L. Z., Yu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordate+(amphioxus)+embryos:+procurement,+culture,+and+basic+methods.">Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods.</a> Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).</li><li>Holland, L. Z., Onai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+gene+function+in+amphioxus+embryos+by+microinjection+of+mRNAs+and+morpholino+oligonucleotides.">Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides.</a> Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).</li><li>Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+microinjection+method+for+unfertilized+eggs+of+Asian+amphioxus+Branchiostoma+belcheri.">An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri.</a> Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).</li><li>Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-targeted+green+fluorescent+protein+reliably+and+uniquely+marks+cells+through+apoptotic+death.">Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death.</a> Cytometry. 43, 273-278 (2001).</li><li>Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+nuclei+in+Aspergillus+oryzae+with+EGFP+and+analysis+of+the+number+of+nuclei+in+each+conidium+by+FACS.">Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).</li><li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD.">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li><li>Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+preferred+nucleotide+sequences+around+the+translation+initiation+codon+in+eukaryote+genomes.">Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).</li><li>Deheyn, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+green+fluorescent+protein+(GFP)+in+amphioxus.">Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus.</a> Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).</li><li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+acts+via+Hox1+to+establish+the+posterior+limit+of+the+pharynx+in+the+chordate+amphioxus.">Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus.</a> Development. 132, 61-73 (2005).</li><li>Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

במאמר זה, אנו מציגים, בפעם הראשונה, פרוטוקול מפורט ושחזור להזרקה של B. ביציות lanceolatum, אשר, לאחר B. הדגלונים 13,14 ו- B. 15 belcheri, לכן מיני amphioxus שלישיים, שלטכניקה כזו שתוארה. חשוב לציין, הפרוטוקול מתואר כאן כולל גם את התיאור של מערכות וקטור המ?...

במהלך פיתוח, תא בודד מוליד כל אורגניזם בתהליך מורכב ביותר שיש בו שני חלוקות תא ותנועות. כדי להבין טוב יותר את העקרונות הביולוגיים העומדים בבסיס הדינמיקה של התנהגות תא, ביולוגים התפתחותיים החלו להשתמש בטכניקות ההדמיה vivo הקרינה מבוססת. תאים מסוימים של תאים, כגון קרום תא, יכולים גם להיות שכותרתו על ידי טיפולים עם צבעי ניאון, גישה הקשתה על ידי חוסר הייחוד ושל חדירת רקמת 1, או על ידי ההקדמה הספציפית לעובר של mRNAs אקסוגניים קידוד חלבוני ניאון 2. טכניקות שונות יכולות לשמש לאספקה ​​היעילה של תרכובות חיצוניות, כגון mRNAs. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ל, microinjection, electroporation, הפצצה עם microparticles, lipofection ותמרת 3,4. למרות שכל הגישות הללו יכולים לשמש כדי להציג את התרכובות אקסוגניים לפיתוח עובר, רק microinjection מאפשר היישום של כמויות מוגדרות מראש ומדויקות לכל תא 3. טכניקות Microinjection תוארו עבור כל מערכות המודל ההתפתחותי הגדולות 4 (לדוגמא, זבובי פירות, נמטודות, דג הזברה, צפרדעים, עכברים), כמו גם לכמה מודלים חלופיים 4, כוללים אלה המשמשים למחקרים השוואתיים שמטרתו להבין את האבולוציה של מנגנוני התפתחות (למשל, שושנות ים, תולעי תולעים טבעתיים, קיפודי ים, tunicates ascidian, amphioxus מיתרני הראש). Cephalochordates, אשר יחד עם tunicates ובעלי חוליות להקים מַעֲרָכָה chordate, במיוחד דגמים מתאימים היטב לחקר האבולוציה של chordates והגיוון של בעלי חוליות מאב קדמון חסר חוליות 5-8. שושלת מיתרני הראש התפצלה בשלב מוקדם מאוד במהלך האבולוציה chordate; וcephalochordates הקיים, אשר מחולקים לשלושה genera (Branchiostoma, Asymmetron וEpigonichthys), דומה לבעלי חוליות הן מבחינת האנטומיה כוללת ואדריכלות הגנום 5-8. של המינים על 30 של cephalochordates שתוארו עד כה, חמש זמינים למחקרים עובריים והתפתחותיים 6,9: lucayanum Asymmetron (אִזְמֵלוֹן בהאמה), מיתרני ראש הדגלונים (amphioxus פלורידה), lanceolatum מיתרני הראש (amphioxus האירופי), מיתרני הראש belcheri (amphioxus הסיני) ומיתרני הראש ג&#39;אפוניכאם (amphioxus היפני). מבוגרים הבשלים של שלושה ממינים אלו (lanceolatum ב &#39;, ב&#39; ו- B. belcheri ג&#39;אפוניכאם) יכולים להיגרם ללהשריץ על פי דרישה בעונת הרבייה 10,11. בנוסף, לפחות עבור B. lanceolatum, השרצה יעילה יכולה גם להיגרם במי ים מלאכותיים 12, ובכך הופכת את מיני מיתרני ראש מסוימים הזה נגיש לLaboratories שאין להם גישה למי ים טבעי. שילוב, בB. lanceolatum, של גישה נוחה ואמינה לעוברים עם שיטת אספקה ​​יעילה, כגון microinjection, עד כה טכניקת המשלוח בלבד שפותחה בamphioxus (בשני B. דגלונים וB. belcheri) 13-15, תאפשר הפיתוח של חבילת רומן של טכניקות מניפולטיביות, כולל tracing- שושלת וגישות המבוססת על התנהגות תא דינמי. פרוטוקול לmicroinjection יעיל של mRNAs לבטא חלבוני ניאון בB. עובר lanceolatum פותח ומכאן. יתר על כן, כדי לספק ערכת כלים בסיסיות להדמית חיה של B. עוברי lanceolatum, מערכות וקטור פותחו המאפשרות קרום הקשורים וביטוי גרעיני של חלבוני ניאון. למיקוד קרום, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) התמזג לתיבה האנושית HRAS CAAX ולוקליזציה גרעינית של mCherry וeGFP היהמתקבל על ידי היתוך לאקסון 2B היסטון דג הזברה (H2B) (איור 1, קובץ משלים 1). יתר על כן, במטרה לייעל את תרגום חלבון, הרצפים וקודונים קוזאק של המבנים שונו והותאמו לשימוש בB. lanceolatum. יחדיו, וקטורי שיטת ההזרקה וביטוי שהוצגו כאן ישמשו כבסיס לדור של גישות ניסיוניות החדשות לcephalochordates, בעיקר ניתוחים באמצעות מבוססת הקרינה האחרונה בטכניקות ההדמיה vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

הפרוטוקול המפורט לעיל מספק את הבסיס לmicroinjection של B. ביציות lanceolatum ומכאן למבוא לפיתוח ב &#39; עוברי lanceolatum של mRNA קידוד חלבוני ניאון להדמית in vivo. למרות שהטכניקה היא בהחלט חזקה ואמינה, שיעור הזריקות מוצלחות תוך שימוש בפרוטוקול זה נשאר משתנה (טבלה ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes at JoVE.com

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב<em&gt; Lanceolatum מיתרני הראש</em&gt; על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

אימונולוקליזציה פלואורסצנטית של חלבונים ערבינוגלקטניים ופקטינים בחומת התא של רקמות הצמח

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...