Name: methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans
Uploaded: 2014-11-13T14:00:00
Duration: 10 min 13 s
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This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1.株、文化、および顕微鏡<ol><li>ハンドルと以前に19を説明したように、線虫株を維持する。株は線虫遺伝学センター（CGC）から入手できます。 NOTE：ミトコンドリアおよび核に局在化GFP融合タンパク質をこれらの実験で使用した菌株は、CB5600（ 彼-8（e1489）IV; Pmyo-3 :: Mtgfp）I ccIs4251（Pmyo-3 :: Ngfp-lacZをする ）であった。 PJ727（jls01（ミオ-3 :: GFP、ROL-6（su1006））;のunc-54 :: lacZを V）収縮装置とPD55（ccIs55（SUP-7（ST5）に局在化GFP融合タンパク質と、unc- 54 :: lacZの細胞質ゾルに局在化βガラクトシダーゼ融合タンパク質を含む）V）。 </li><li>以前に多世代RNAi実験13について記載したシーケンスからのRNAi細菌を得るように、完全なRNAi実験は、マルク·ビダルら 12により構築ORF-のRNAiライブラリを検証した。 </li><li>含有する株を構築する&lt;em&gt;のCCIS 4251、jls01またはCCIS 55は、標準的な技術を使用して20。それぞれ、ミトコンドリアのネットワーク構造、ミオシン組織やタンパク質恒常の状態を評価するために歪みを作成するには、これらの導入遺伝子を使用してください。すべての動物におけるこれらのサブ細胞区画の一つを見てを所望する突然変異体に菌株を渡ります。 </li><li>以前に21を説明したようにのPtdIns-3-キナーゼ阻害剤、LY-294002（LY）を使用します。簡単に言うと、ドライOP50シードNGMプレートの上に160μMの最終濃度でLY-294002を追加します。 </li><li>一般的に、GFPベースの実験のためのGFPフィルターおよびC 32 H 32 Cl 2を N 2 Oとの生体内膜電位に評価するために、同時に、赤、緑及び青のチャネルの画像化を可能にするトリプル·パス·フィルタを有する顕微鏡を使用して、すべての画像をキャプチャのMitoTrackerレッドCMXRosとして販売。画像処理ソフトで画像解析し、図の準備を行う。 </li></ol><ol><li>前に必要とされる最低1日、M9バッファーを作る- 22.04 mMのKH 2 PO 4、42.27ミリモルのNa 2 HPO 4、85.56のNaCl（最終濃度）、およびオートクレーブで滅菌する。一旦45℃まで冷却し、析出22を防止するために、オートクレーブ処理後、1 mMのMgSO 4を滅菌加える。 M9は50ミリリットルチューブに4℃と一定分量で冷却することができます。 </li><li>実験の日に、L1の幼虫数の多いシングル9センチメートルプレートに3ミリリットルM9バッファーを追加します。角度で保持プレートと寒天の表面に対してM9液とピペッティングを吸引することにより、繰り返しプレートを洗ってください。 </li><li>プレートから、L1のを洗い、次にピペットを用いて10ミリリットルの試験管にM9を移す。 </li><li>大きな大人と後で幼虫期の動物は試験管の底に落下することを可能にするために2.5分間のままにして、小さい方のL1動物はトン近く残るM9バッファーのオペアンプ。 </li><li>ピペットを用いて試験管内でM9のトップ500μlのを削除します。次に、新しいNGMプレートにM9を含む、L1幼虫をピペット解剖スコープの下で500μlのOP50を播種。 </li><li>一般的に、プレートあたり〜200-300のL1幼虫を転送することを目指しています。毎日の成人期からプレートを監視し、必要に応じて、消費されているOP50の食料源を防止するために、新鮮なOP50 NGMプレート上に動物を選ぶ。 注：これは主に、原版上のL1の数に応じて異なるが、これは、通常、P1000ピペットを用いてM9 1-3滴である。 </li><li>個々の動物での前向き研究が必要な場合は、動物が成人期に達すると、シードされたNGMプレートを分離するために個々の動物を選ぶ。転送動物ごとに24〜48時間は幼虫の動物から分離する。 </li></ol> 3.運動アッセイ19 <ol><li>実験を開始する前に、2時間の最小値、M9 50mlのアリコートを除去し、室温に平衡化させるerature。 </li><li>顕微鏡スライド上に50μLのM9緩衝液中に、単一の成体動物を選ぶ。 </li><li> 1左方向及び右方向に曲がり1つのストロークに等しい10秒の左及び右方向の本体屈曲部の数を数える。 </li><li>平均値をとることが可能な少なくとも5つの測定値の合計を与えるために、本体のストロークのカウントを繰り返す。分あたりの移動速度を与えるために6によってこれらの数字を掛けます。 </li><li>ピペットを用いて、ペトリ皿に戻って動物を移す。この方法は、C.エレガン s内の全体の寿命を通して運動の時間的な測定を可能にします。 </li></ol><img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> 図1：運動アッセイ。ワームは、バッファに取得されたら、次に、左方向（A）と一つ右方向（B）の曲げは一つの完全な動きを与えるように加算される（ストローク）。 ボディ壁筋におけるミトコンドリアネットワークとサルコメア4.イメージング<ol><li>注：同じプロトコルは、ミトコンドリアとサルコメアの両方のイメージングのために適用されます。 </li><li>前述した（第1節）のようなワームを同期させ、彼らが青年期に達する時20℃で48-60時間、成長する。 </li><li>顕微鏡スライド上に20μLのM9にプレートから20ワーム（プレートの代表）を選ぶ。 </li><li>カバースリップを適用し、40Xの倍率でGFPフィルター（460から500 nmの青色光励起）の下に、蛍光顕微鏡を用いて画像に進みます。 </li></ol> 5.のMitoTrackerレッドCMXRos（C 32 H 32 Cl 2の N 2 O） を用いたin vivo蓄積アッセイを使用して膜電位の評価<ol><li> CB5600（第1節）、筋肉のミトコンドリアにおけるGFPで標識されたすべてを同期させると、20℃で48-60時間、NGM含むOP50上の成人早期に成長する。 </li><li> 940.692μMのストック溶液を作るために、C 32 H 32 Cl 2の N 2 Oの50μgのアリコートに100μlのDMSOを追加します。 </li><li> 940.692μMストック溶液1μlを取り、4.70μM（4.70346μM）の作業溶液を作成するために199μlのM9に懸濁します。 C 32 H 32 Cl 2の N 2 Oが感光性であるので、茶色の1.5ミリリットルチューブ内でこれを準備します。 </li><li>ワーキング溶液4.70μM20μlのアリコート（20μlのアリコート当たり20成虫）を準備します。 </li><li>ブラウン1.5ミリリットルチューブ内のC 32 H 32 Cl 2の N 2 O 4.70μM20μlのに20成体動物を選ぶ。 1時間20℃でインキュベートする。 </li><li> 1時間のインキュベーション後、10秒間2000×gでワーム、遠心分離機を含む茶色の1.5ミリリットルチューブに1ミリリットルM9を追加し、上清を除去。ワームペレットを再懸濁し、残りの20μを転送する前に、この洗浄ステップを繰り返しますlはイメージングのためのスライドに（虫を含む）。 </li><li>同時に、赤、青、緑のチャネルの可視化を可能にするトリプル·パス·フィルタを使用して40倍の倍率でミトコンドリアの画像を撮る。トリプルパスフィルタを用いた撮像がオレンジ色として現れるミトコンドリアに局在するGFPを有するC 32 H 32 Cl 2を N 2 Oの共局在を示す。 </li><li>オレンジ色のミトコンドリアの画像を撮影除去すべてのフィルタと最大設定に以下を25分の540の波長の光を用いて10秒間動物フォトブリーチした。これは、ミトコンドリア内の赤を漂白し、筋肉のミトコンドリア内共局在を確認するために、一人でミトコンドリアGFPを明らかにする。 </li></ol> 線虫の筋肉タンパク質分解の6評価<ol><li> NGMプレート上にPD55s（ 又は LacZ導入遺伝子を含む任意の株）を同期させるには、OP50（第1）を播種。 2で48-60時間、青年期に成長0°C。 </li><li>顕微鏡スライド上に20μlのddH 2 O中に20成虫を選ぶ。試してみて、唯一のワームやピックを持つていない任意の細菌を選択するように注意してください。鉛筆での顕微鏡スライドにラベルを付けます。 </li><li>動物のキューティクルを乾燥し、クラックする30分間デシケーター中に置きます。シールの周りにグリスを使用してデシケーターに気密シールを確認してください。 </li><li>乾燥は解剖スコープ（ 図2）の下で有効であった確認してください。 </li><li>スライド上のアセトンを蒸発させるために15分間室温でペーパータオル上で顕微鏡スライドを残して、次に3.5分間氷冷アセトン中で顕微鏡スライドを沈める。この時点で、X-galおよび酸化緩衝液を解凍し、室温に平衡化を可能にする。 </li><li>優しくこれが均質であることを確認するために、酸化バッファーとボルテックスμlの100に2μlのX-galを追加します。これは、X-galを/酸化バッファマスターミックスです。 </li><li> OそれぞれにX-galを/酸化バッファマスターミックス20μlのを追加します。20ワームのriginalエリア。マスターミックスを完全に完全にすべての動物を網羅確実にするために解剖スコープの下で点検します。穏やか動物はカバーされない領域の上にマスターミックスを移動するために顕微鏡スライドを傾ける。 </li><li> 20℃で1〜2.5時間、湿度室で顕微鏡スライドを置きます。画像動物濃い青色は、対照動物の体壁の筋肉中に存在する。動物が画像化されるべきであるかを決定するために15分ごとに解剖スコープの下に対照動物を評価する。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> 図2：βガラクトシダーゼアッセイを用いて、筋肉タンパク質分解の評価。 のlacZ導入遺伝子を含む（A）動物は、顕微鏡スライド（B）上に20μlのddH 2 Oにペトリ皿から取得されます。動物は、乾燥され、骨折になる<sチョン&gt;（C）。次いで、動物を、アセトン（D）で洗浄する。アセトンは、X-galを/酸化緩衝マスターミックスを蒸発させると（E）を添加する。濃い青色が動物（L）の長さにわたって得られるまで、対照動物における青色の発色をt = 0分（F）から15分間隔（FL）で評価される。ワームの画像は、 フロリダ州にAEと8Xに2.5Xの倍率で撮影されている。 C、D、F、G、およびLにズームし、元の倍率4Xである。

The authors have nothing to disclose.

筋肉はよく歩行、姿勢サポートや代謝におけるその役割のために認め多機能組織である。健全な筋肉の開発と保守には、複数の細胞プロセスとコンポーネントの調整を必要とします。どちら損傷または疾患を通じて、調節不全は、変更された筋肉構造および/または機能で、その結果、発生する可能性があります。筋機能における加齢に伴う筋肉量の減少1,2、特に筋力と持久3-5は負の死亡率と相関していることから、西側世界におけるヘルスケア予算に大きな負担を提示します。そのような改変されたミトコンドリア機能またはサルコメア混乱などの筋機能の悪化に関連した側面の測定は、全体的な筋肉の発達と健康を支えるメカニズムのより深い理解を可能にすることができる。 C aenorhabditis虫（C.エレガンス ）微視的線虫BESですそれは、その全ゲノムを持つ最初の多細胞生物は、6の配列を決定したRNAi 7を使用して沈黙する遺伝子を持って最初の、そしてその全体の細胞系譜8および神経解剖学9に決定。 線虫を持っている唯一の後生動物が最初として提案されただったので知らトンシドニー·ブレナー10と、このことの重要性とそれに続く作品による1974年の行動の遺伝的制御の研究のためのモデルは、 線虫の研究者に授与さ3ノーベル賞の最初に認識された。 C.の約35％が、遺伝子がC.エレガンスは、筋肉の発達11の遺伝子制御を理解するために使用されるキーである生物を、ヒトにおいてオルソログを同定したエレガンス 。ほとんどのC. elegansのゲノムにおける全ての遺伝子は、RNAi 7,12を通じてノックダウンすることができます。このように、完全に開発筋肉中の遺伝子をノックダウンすることにより、遺伝的コンポーネントは再に貢献筋肉の健康のgulationは相対的なシンプルさ13を用いて調査することができます。 組み合わせたRNAiを使用する能力、変異体、および化学化合物がCで 16歳と疾患モデルにおける17の筋肉の構造と機能の遺伝的調節7,14,15を探索するのに最高のシステムを虫になります。遺伝子ノックダウン、突然変異、および/または筋肉の構造および/または機能に対する化学物質への暴露の影響は、複数の側面を介して測定することができる。ここでは、簡単に筋肉の健康の前向き研究において使用され得る多くはC. elegansの筋肉の構造および機能を評価するための簡単な技術を記載している。 緑色蛍光タンパク質（GFP）18の開発は、特定のタンパク質の局所性およびC.エレガンスにおける細胞小器官の一般的な構造の両方の可視化を可能にした。ここでは、GFPがspeciを表明方法について説明しますこれらのサブ細胞構造のジストロフィーが存在する場合fically体壁筋のミトコンドリア、核、またはサルコメア内で決定することができる。構造が常に機能するための信頼できるサロゲートはないので、我々はまた、in vivoでのカチオン染料の使用は、筋肉内の障害のあるミトコンドリア膜電位の評価を可能にする方法を説明します。染料がGFPと組み合わせて使用​​される場合、それらは、寿命全体を通じて、時間的な方法でアーキテクチャおよび機能の研究を可能にする。最後に、我々はまた、これらの手段の全ての移動アッセイの使用を介して、全動物の筋肉の健康の変化を相関させるために使用することができるか、筋肉内のタンパク質恒常性を評価することができると方法について説明します。遺伝子ノックダウン、突然変異、および/ ​​または化学的化合物と組み合わせたこれらの技術は、特定の遺伝子または化合物がインビボでの筋肉の健康にどのように影響するかを研究するための強力な武器を提供する。 C. elegansのと間の構造、代謝と筋肉の総機能の類似点哺乳類は、線虫を意味するヒトを含む高等生物、筋肉の調節を理解するための、優れたモデル生物である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:195px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

筋肉は栄養、運動、および疾患状態の変化に応答する動的な組織である。病気や加齢に伴う筋肉量および機能の喪失は、重大な公衆衛生上の負担です。我々は現在、病気や加齢に伴う筋肉の健康の遺伝的調節についてはほとんど理解しています。線虫C.エレガンスは、関心のある生物学的プロセスのゲノム調節を理解するための確立されたモデルである。このワームの体壁の筋肉は、より高い後生動物種の筋肉との相同性の程度が大きい表示。 C.エレガンスは 、透明有機体であるため、ミトコンドリアおよびサルコメアのGFPの局在は、in vivoでのこれらの構造の可視化を可能にする。同様に、動物のミトコンドリア膜電位の有無に基づいて、蓄積するカチオン染料を送り、in vivoでのミトコンドリア機能の評価を可能にする。筋肉タンパク質homeostaこれらの方法、ならびに評価sisの、筋肉の性能の機能的尺度を持つ細胞内の欠陥の相関を可能にするために、移動アッセイの形式で、全動物の筋肉機能の評価と組み合わされる。したがって、C.エレガンスは、筋肉の構造と機能に、変異の影響を評価するための強力なプラットフォームを提供し、遺伝子ノックダウン、および/ ​​または化学的化合物である。最後に、GFP、カチオン染料、および移動アッセイとして評価されている非侵襲的に、筋肉の構造および機能の前向き研究は、全ライフコース全体で行うことができ、現在では、これは容易に他の生物においてインビボで調査することができない。

ムーブメント欠陥を定量化するために運動アッセイ 運動の減少はCで死亡率の良い予測因子であるelegansの 16、と、神経筋システムの問題を示す率を減少させた。動きの変化は、運動アッセイにより評価されるように、特定の遺伝子または薬物治療（ 図3-5）に対して、又は13変異体動物においてRNAi 23から生じ得る。運動の減少は複合体I、III、IVまたはV 24をコードする電子輸送遺伝子のダウン発達ノック以下、例えば、変更された開発から生じ得る。さらに、特定の介入後の発達生理学上の効果を調べるためにのみ成体C.エレガンスで試験することができる。例えば、動物はエンコードUNC-112、に対するRNAiで処理されたC.は含むインテグリンに局在しているKindlin-1のオルソログエレガンス筋肉付着複合体（ 図3および4）、またはガス1、電子伝達鎖（ 図4）との複合体Iの成分をコードし、48〜72時間後に成人の対照に対する動きの漸進的減少を示す。これは、筋生理学の問題を示すことができる。同様に、24からの移動の損失- 72時間のPI3K阻害剤LY-294002（ 図5）を用いた処理による正常に発生し、成人の処置に応答して観察される。これは、初期の介入に応答して減少する動きを示す動物の動きを復元する第二のRNAi処理、突然変異、または薬物の効果を試験することも可能である。たとえば、unc- 112変異体は薄暗い-1 13における第二の突然変異の存在下で減衰され、野生型動物と比較して動きの定量化の減少が表示されます。したがって、運動アッセイはneuromuscuを変えるの両方の介入を識別することができますLARの開発および/または機能ならびに改善、および/または神経筋の機能を回復させるもの。 サルコメア破壊の評価 運動欠損を同定したが、それは運動欠陥の原因は、神経、筋肉、またはその両方内の問題によって説明することができるかどうかを決定することが望ましいことが多い。サルコメアの収縮を可能にし、従って、生成および移動を強制的に筋肉内の多タンパク質複合体である。収縮装置に局在ミオシンGFP融合タンパク質を発現する動物を利用することにより、ミオシンフィラメントとサルコメアの混乱の程度は、発生および/または成人期を通して個々の動物において、比較的非侵襲的かつ前向きに観察することができる。野生型動物は各ボディ-壁筋内などの複数の緑色平行な直線（ 図3）が表示され、アレイ筋節を表示します。これらの正常な配列への破壊は、比較的マイナーかもしれ並行して残っているのではなく、マージする登場並ぶサルコメア。 tでのunc-112 RNAiを可視この表現型は、= 24時間または48時間（ 図3）は 、哺乳動物の筋肉内のアクチン結合部位のZラインストリーミングと同等である。同様に、配列の小さな部分は折りたたむことができ、またはそれらは、完全にそのようなT = 48時間またはT = 72時間でUNC-112のRNAiを用いた治療（ 図3）のように消えることができます。運動欠陥を表示する動物の筋肉内サルコメア欠陥の存在（ 図3）は、運動欠損を説明するのに十分であるが、必ずしも介入に応答して、筋肉、神経、および/ ​​または他の組織との他の問題を除外するものではない。 ミトコンドリアネットワーク構造の評価 運動欠損の存在下ではそれが発生したり、移動デに寄与することができる他の欠陥のために筋肉を調べることが望ましい場合があるfect。ミトコンドリアは、細胞エネルギーの大部分を提供し、筋収縮のために利用可能なエネルギーを減少させる、減少ATP提供の結果である可能性運動低下する。したがって、ミトコンドリアの構造異常を調べることができる。それは迅速なミトコンドリアの断片化を誘導するようにアジ化ナトリウムで動物を麻酔しないことが重要である。これらの実験動物は、カバースリップによって加えられる圧力によって固定化した。野生型C.エレガンスの中 体壁筋のミトコンドリアの構成はネットワーク（ 図4）内に収容され、ミトコンドリアは胞体25として存在し、機能する。ミトコンドリアのネットワークの破壊は、ネットワーク（ ガス-1のRNAi、 図4B）26の断片として提示します。断片化は、組織化ネットワークのないうわべだけがUNC-112のRNAi（ 図4BおよびC）13を用いた治療など残っていないことを十分に厳しくなることがあります。のWiとしてサルコメア構造における番目の混乱が、運動欠陥を表示する動物の筋肉ミトコンドリア構造の欠陥は、運動欠陥を考慮するのに十分であり得るが、これは必ずしも、筋肉、神経、および/または他の組織との他の問題を除外するものではない。たとえば、UNC-112変異体13と治療UNC-112のRNAi（ 図3および図4）ディスプレイの両方破砕サルコメア持つとは、ミトコンドリアの構造を破壊した。 インビボでのミトコンドリア機能の評価 ミトコンドリア膜電位は、したがって、インビボでミトコンドリア膜電位を評価する能力は、ATPを生成するためにその動物の能力を示し、プロトン駆動力を作成し、ATP 27を生成するミトコンドリアの能力を決定する。ミトコンドリアの構造的混乱がまたはミトコンドリア機能的能力を変化させてもしなくてもよいように、それは指名打者かもしれrableは、変化したミトコンドリアの構造を示す動物におけるミトコンドリア機能を評価した。 C 32 H 32 Cl 2を N 2 Oは、膜電位が存在し、ミトコンドリア28（ 図4C）を染色するすべての細胞型のミトコンドリアに蓄積する。具体的には、筋肉内のミトコンドリア機能を評価するためには、C 32 H 32 Cl 2を N 2 Oを使用することができ、GFPは、具体的には、筋肉ミトコンドリア（ 図4C）に基づい介入の効果を実証するために、筋肉のミトコンドリアを標識した。たとえば、UNC-112のRNAiで処理した後のミトコンドリア膜電位の損失はマトリックスに入るから、C 32 H 32 Cl 2の N 2 Oを防ぎます。ミトコンドリアのGFP標識（ 図4C）に加えて、ミトコンドリアのいずれレッド染色した場合、ミトコンドリアは、したがって、少しを示している。光退色は観察されていることを確認するためにも使用することができミトコンドリアは、特に筋肉（ 図4C）のものである。 ATPを産生する能力の減少の同定は、観察された運動欠陥を考慮するのに十分であるが、筋肉、神経、および/または他の組織内の他の問題を除外するものではない。縮小ATPの生産能力は、ヒト29,30老化疾患状態と関連しているにかかわらず、介入に応答したそのような欠陥の識別はATP生産能力を向上させ、これらはその後もよい化合物および/ ​​またはRNAi治療のためのスクリーニングのためのプラットフォームを提供さらなる治療の可能性について検討される。 タンパク質分解の評価 運動欠陥と正常サルコメアとミトコンドリアの存在下でそれが発生したり、運動欠陥に寄与し得る他の欠陥のために筋肉を検査することが望ましい場合がある。タンパク質恒常性を維持する能力は、署名されずタンパク質合成および/ ​​またはタンパク質分解の増加の減少に対し、発作の健康は、31と、複数の疾患状態32,33老化の結果である。従って、変化したタ​​ンパク質ホメオスタシスの移動欠陥を有する動物の筋肉を検査することが望ましい場合がある。これは、細胞質、筋肉タンパク質のレベルの評価を介して達成することができる。トランスジェニックコードされたタンパク質の使用は、筋特異的タンパク質恒常性の評価を可能にします。例えば、βガラクトシダーゼを含む動物の使用は、ミオシンのN末端 ​​部分に融合され、それは、ミオシンプロモーターの制御下で合成され、エンハンサーはサイトゾル筋タンパク質含量19の評価を可能にする。野生型成人におけるブルー染色の存在は、活性なβガラクトシダーゼおよび病理学的細胞質タンパク質の分解の有無を示している。治療に応答した染色の喪失は、病的なタンパク質分解（ 図5を発生している示唆している</strong&gt;）、βガラクトシダーゼ72安定であるように-野生型の成人13,14,19 96時間後成人期。 LY-249002で処置した動物は、汚れの欠如を示すのに対し、例えば、未処置の野生型動物では、成人期の後に（ 図5）強烈なブルー染色72時間を表示する。サルコメア構造およびミトコンドリア機能の欠陥と同様に、病理学的な筋肉タンパク質分解の存在が観察された運動欠陥を考慮するのに十分であるが、必ずしも、筋肉、神経、および/または他の組織との他の問題を除外するものではない。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> 図3は：（A） のunc-112のRNAiは、t = 72時間で有意運動欠陥を引き起こす体壁筋肉内に配列されたバンド構造の（B）の評価。 wの中トン、筋肉中のバンドは青年期（T = 0時間）で直線として表示され、（重量ズームを参照）成人期の72時間を越えてまで、大部分が均一なままです。UNC-112 RNAiはサルコメアはの小さな領域でアーキテクチャを失う原因となる筋肉（T = 24時間）は、崩壊し、行方不明の筋節（T = 48時間）、アグリゲーション（T = 72時間、トップパネルとズーム）とサルコメアの直線性（T = 72時間のボトムパネルとズーム）の損失。スケールバーは2.5倍である25μMおよびズームを表します。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> 図4（A） のunc-112またはガス-1 RNAiは、運動欠損を引き起こす、体壁筋内のミトコンドリアの構造（B）の評価。筋肉内のミトコンドリアは、青年期（重量）でのようなネットワーク上の直線で表示されます。 mitochondrにおけるUNC-112のRNAi結果と動物の処置以前に24時間と成人期（ズームや矢印）13の72時間の間で観察されるように、IALフラグメンテーション。同様に、ミトコンドリアのネットワークの断片化ガスに対するRNAi -1の結果は、以前に26を観察されたように。これらには、72時間（ズームや矢印を参照）。in vivoでのミトコンドリア膜電位の（C）のアセスメントで広まっ解体にはt = 24時間と進捗状況でミトコンドリアのネットワーク内に小さなギャップとして存在している。また、ミトコンドリアに局在するGFPを含む動物では、C 32 H 32 Cl 2を N 2 Oは、体壁筋のミトコンドリアに蓄積し、72時間後に成人期まで、青年期（t = 0の時間）から、トリプルパスフィルターの下にオレンジ色になります。残りのミトコンドリアはC 32 H 32 Cl 2を N 2 O重量対の少ない蓄積を示し、72時間で示されるように、UNC-112 RNAiを用いた処置は、膜電位の進行性の喪失を引き起こす。 10 SEの退色C 25分の540 nmの光漂白剤をのMitoTrackerから赤を使用し、筋肉のミトコンドリア（+写真漂白剤）に局在GFPを明らかにする。スケールバーは2.5倍であるには25μmやズームを表します。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> 図5：LY-294002動物と（A）治療は、運動欠陥を誘発するβガラクトシダーゼアッセイを用いてタンパク質分解の（B）の評価。 L1幼虫wtの同期された年齢は、OP50（重量対照）またはNGMを播種NGMに移す前に20°C（t = 0の時）で青年期まで増殖させ、20℃で24時間LY-294002（PI3Kインヒビター処置）​​を播種する。 Aでは、約20〜30匹の動物をt = 0時間目および24時間、48時間および72時間後に、βガラクトシダーゼ活性（青色）について染色されている。

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