Name: preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Forfatterne har ingen bekræftelser.

1.. Mica og Slides Forberedelse <ol><li> Sted nr. 1 ½ (0,17 mm) dækglas i farvning rack. </li><li> Soniker i 30 minutter i 2% vaskemiddel ved 60 ° C. </li><li> Vask 20 gange med deioniseret vand. </li><li> Fjern slides med pincet og blæs tør med trykluft eller nitrogen. </li><li> Skær glimmer ark i 10 x 10 mm kvadratiske stykker med saks eller barberblad. </li><li> Skær hver glimmer stykke ind i 2-3 tyndere foldere hjælp barberblad. BEMÆRK: Dette trin kræver brug af skarpe klinge. </li></ol><p class="...

<ol>
	<li>Giocondi, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topography+of+membrane+domains.">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li><li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures.">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li><li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+supported+lipid+bilayer+study.">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li><li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers.">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li><li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions.">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li><li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+supported+lipid+bilayers:+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics.">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li><li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af glatte og tynde glimmer overflader til lipiddobbeltlag deposition og høj opløsning. Teknikken kræver minimal manuelle færdigheder, begrænset meste til omhyggelig adskillelse af glas glimmer sandwich (trin 2.8), som er afgørende for at opnå en høj kvalitet glimmer overflade. Inspektion af frisk spaltet glimmer altid påkrævet på dette tidspunkt, da det er muligt for glimmer at løsne sig fra den optiske lim uden spalte, der forlader udsatte områder...

Det overordnede mål med denne protokol er at vise en metode til fremstilling af glimmer overflader for høj opløsning billeddannelse af glimmer understøttede lipid dobbeltlag (SLBs) bruger optisk total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM) eller konfokal mikroskopi, som også kunne kombineres med atomic force mikroskopi (AFM). SLBs er en udbredt model til utallige undersøgelser af lipid klyngedannelse, faseadskillelse, dynamik dobbeltlagsmembraner komponenter eller deres interaktion med peptider, proteiner eller andre forbindelser 1-5. Forskellige substrater kan anvendes til SLB dannelse (dvs. glas, glimmer, siliciumdioxid, polymerer), afhængigt af arten af undersøgelsen 4,6-8. Undersøgelser Typiske membran stole på mikroskopi-baserede imaging teknikker, såsom TIRFM og AFM. Således TIRFM billeddannelse, en glasoverflade er et typisk valg, fordi glas er gennemsigtigt. Fremstilling af glas er forholdsvis let, og kvaliteten af ​​de resultater, primærtbestemmes ved grundig rengøring af overflader før aflejring af lipidvesikler. AFM grund af sin høje aksiale opløsning kræver glimmer overflader. Mica er et silikat mineral, med tæt på perfekt basal spaltning. Således frisk kløvet glimmer er atomically flad, så observation af membran højdeforskelle selv på sub-nanometer skala 9. Diffusion undersøgelser ved hjælp af metoder som fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), enkelt molekyle sporing (SMT), og fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) viste dog, at lipid membran dynamik afhænger i høj grad af den type overflade, på hvilken de er deponeret, hvorved glas og glimmer kan give vidt forskellige resultater 10,11. Disse forskelle omfatter ikke kun diffusionskoefficienterne af membranen sonder, men også påvisning af separate populationer af partikler diffunderer med forskellige satser, og muligvis skifte mellem forskellige stater. Såledesden direkte sammenligning af resultater opnået ved brug TIRFM og AFM teknikker er ofte problematisk, med mindre den samme overflade (i dette tilfælde glimmer) er anvendt. Selvom der er nogle undersøgelser, hvor TIRFM og AFM tolags imaging blev udført på samme glimmer overflade 12,13 er glimmer sjældent bruges til optisk mikroskopi, hovedsagelig på grund af problemer med papirhåndtering. Glimmer forberedelse kræver skæring med hånden i tynde foldere, som derefter limet til dækglasset bruger optisk lim 12. Denne metode kræver dog lidt øvelse at opnå tilfredsstillende resultater. Desuden overfladerne opnåede ofte bølget og tyk, hvilket gør dem svære at bruge med lav arbejdstid afstand, høj numerisk blænde objektiver. Glimmer overflader fremstillet som beskrevet i denne protokol er meget tynde (~ 220 um, herunder dækglasset tykkelse på 170 um) og ekstremt fladt, så man undgår &quot;waviness&quot;, som er afgørende for en vellykket høj opløsning billeddannelse. De kan brugesfor TIRFM eller konfokal opsætninger. Desuden kan de samme prøver overføres til AFM, og selv afbildes samtidigt med TIRFM / konfokal og AFM. Ved at kombinere disse to teknikker giver mulighed for direkte korrelation mellem diffusion adfærd med dobbeltlaget membran struktur 14. Fordi glimmer overflader er frisk spaltes, de er rene og ikke kræver tidskrævende, dårligt reproducerbar, og potentielt farlige rengøringsprocedurer (glas rengøring protokoller normalt omfatte kemikalier såsom Piranha løsning, svovlsyre, natrium / kalium-hydroxid). Montering af et lille kammer, også beskrevet i protokollen, reducerer mængden af ​​vesikler, der er nødvendige for en effektiv dobbeltlagsformation til mindre end 50 pl. Endelig er hele processen med overfladen samling er ikke tidskrævende (forberedelse tager mindre end 30 minutter), og kræver ikke en høj grad af manuel dygtighed, som gør konventionelle glimmer spaltning og limning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="710">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Coverslips 24 x 50mm - No H1.5</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">102222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DOPC</td>
			<td style="width:135px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hellmanex III (detergent)</td>
			<td style="width:135px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">320.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mica V-1 Grade</td>
			<td style="width:135px;">SPI Suppliers</td>
			<td style="width:119px;">1872-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (high viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (low viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sphingomyelin-ATTO647N</td>
			<td style="width:135px;">AttoTec</td>
			<td>AD 647N-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">UV lamp</td>
			<td style="width:135px;">Synoptics Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">GelVue GVM20</td>
			<td>The lamp was set to 100% power</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

Understøttede lipid dobbeltlag (SLBs) er almindeligt anvendt som en model til at studere membranproteiner egenskaber (fase separation, klyngedannelse, dynamik), og dens interaktion med andre forbindelser, såsom narkotika eller peptider. Men SLB egenskaber varierer afhængigt af den støtte, der anvendes. Almindeligt anvendte teknikker til SLB billeddannelse og målinger er enkelt molekyle fluorescens mikroskopi, FCS og atomic force mikroskopi (AFM). Fordi de fleste optiske billeddiagnostiske undersøgelser foretages på et glas support, mens AFM kræver en ekstremt flad overflade (generelt glimmer), kan resultaterne fra disse teknikker ikke sammenlignes direkte, da op-og glathed egenskaber af disse materialer stærk indflydelse diffusion. Desværre højt håndelag nødvendige for skæring og limning tynde skiver af glimmer til objektglasset viser en forhindring for rutinemæssig brug af glimmer SLBs forberedelse. Selv om dette ville være den foretrukne metode, f.eks fremstillet glimmeroverflader ofte ender med at blive ujævn (bølget) og vanskelige at billedet, især med lille arbejdsgruppe afstand, høj numerisk blænde objektiver. Her præsenterer vi en enkel og reproducerbar metode til fremstilling af tynde, flade glimmer overflader til lipidvesikel aflejring og SLB forberedelse. Derudover vores specialfremstillede kammer kræver kun meget små mængder af vesikler til SLB dannelse. De overordnede procedure resulterer i en effektiv, enkel og billig produktion af høj kvalitet lipiddobbeltlaget overflader, der er direkte sammenlignelige med dem, der anvendes i AFM undersøgelser.

Spredningen opførsel af fluorescerende lipid sonder i SLBs er forskellig afhængig af underlaget. TIRFM kombineret med SMT teknik er en værdifuld metode til at visualisere partikel bevægelser og ekstrahere deres diffusionskoefficienter. Enkelt molekyle signaler af en sphingomyelin-ATTO647N probe diffunderer i DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) dobbeltlag understøttet på glas og glimmer er vist på vedlagte animerede figur. Glimmer overflade blev fremstillet ifølge protokollen præsenteret her....

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Vi præsenterer en fremgangsmåde til fremstilling af glimmer understøttet lipiddobbeltlag for høj opløsning mikroskopi. Mica er gennemsigtig og fladt på en atomar skala, men sjældent brugt i billedbehandling på grund af håndtering af problemer; vores forberedelse resulterer i mere aflejring af glimmer ark og reducerer materiale anvendt i dobbeltlaget præparat.

Udarbejdelse af Mica Understøttet lipiddobbeltlagenes for High Resolution optisk mikroskopi Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband optisk detektor af ultralyd til medicinsk billedbehandling

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høj opløsning Spatiotemporal Analyse af receptor Dynamics ved Single-molekyle fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Single Molecule Fluorescens Mikroskopi på Planar Understøttet dobbeltlag

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Ligand Nano-klynge Arrays i et understøttet lipid-dobbeltlag

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Switchable akustisk og optisk opløsning Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In vivo</em&gt; Blodvaskemaskiner i små dyr

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...