Name: preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00
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Les auteurs n&#39;ont aucun remerciements.

1. Mica et diapositives Préparation <ol><li> Lieu n ° 1 ½ (0,17 mm) des lamelles couvre en support de coloration. </li><li> Ultrasons pendant 30 min à 2% de détergent à 60 ° C. </li><li> Laver 20 fois avec de l&#39;eau désionisée. </li><li> Retirer les lames en utilisant des pinces et sécher à l&#39;air comprimé ou de l&#39;azote. </li><li> Couper la feuille de mica en 10 x 10 mm morceaux carrés à l&#39;aide de ciseaux ou d&#39;une lame de rasoir. </li><li> Couper chaque morceau de mica en 2-3 folioles m...

<ol>
	<li>Giocondi, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topography+of+membrane+domains.">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li><li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures.">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li><li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+supported+lipid+bilayer+study.">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li><li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers.">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li><li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions.">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li><li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+supported+lipid+bilayers:+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics.">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li><li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

Ce protocole décrit un procédé pour la préparation de surfaces de mica lisses et minces pour le dépôt de la bicouche lipidique et l&#39;imagerie haute résolution. La technique nécessite des compétences manuelles minimales, limitées essentiellement à la démontage attention du sandwich verre-verre-mica (étape 2.8), ce qui est essentiel pour obtenir une surface de mica de haute qualité. L&#39;inspection du mica fraîchement clivé est toujours nécessaire, à ce stade, car il est possible que le mica se déta...

L&#39;objectif global du présent Protocole est de montrer une méthode pour la préparation des surfaces de mica pour l&#39;imagerie haute résolution de mica soutenu bicouches lipidiques (BLP) à l&#39;aide de la microscopie optique de fluorescence totale de réflexion interne (TIRFM) ou la microscopie confocale, qui pourrait également être combiné avec force atomique microscopie (AFM). BLP sont un modèle largement utilisé pour de nombreuses études de groupement lipidique, séparation des phases, la dynamique des composants de bicouche ou de leurs interactions avec des peptides, des protéines ou d&#39;autres composés 5.1. Différents substrats peuvent être utilisés pour la formation SLB (c.-à-verre, le mica, le dioxyde de silicium, des polymères) en fonction de la nature de l&#39;étude 4,6-8. Des études de membranes typiques reposent sur des techniques d&#39;imagerie à base de microscopie, tels que TIRFM et AFM. Ainsi, pour l&#39;imagerie par TIRFM, une surface de verre est un choix typique parce que le verre est transparent. Préparation de verre est relativement facile, et la qualité des résultats est essentiellementdéterminé par la surface de nettoyage en profondeur avant le dépôt de vésicules lipidiques. AFM en raison de sa haute résolution axiale nécessite des surfaces de mica. Mica est un minéral de silicate, avec près de parfait clivage basal. Ainsi, le mica fraîchement clivé est atomiquement plat, permettant l&#39;observation des différences de hauteur de la membrane même à l&#39;échelle sub-nanométrique 9. études sur la diffusion en utilisant des méthodes telles que la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), seul le suivi molécule (SMT), et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré cependant que la dynamique de la membrane lipidique dépendent fortement du type de surface sur laquelle ils sont déposés, lequel verre et le mica peut donner des résultats très différents 10,11. Ces différences comprennent non seulement les coefficients de diffusion des sondes membranaires, mais aussi la détection des populations distinctes de particules diffusantes avec des vitesses différentes, et éventuellement entre les différents états de commutation. Ainsi,la comparaison directe des résultats obtenus en utilisant des techniques de TIRFM et AFM est souvent problématique, à moins que la même surface (dans ce cas, mica) est utilisé. Bien qu&#39;il existe quelques études où TIRFM et AFM bicouche imagerie a été effectuée sur la même surface de mica 12,13, mica est rarement utilisé pour la microscopie optique, la plupart du temps en raison de problèmes de manutention. préparation de Mica nécessite la coupe à la main en folioles minces, qui sont ensuite collées sur la lamelle en utilisant un adhésif optique 12. Cette méthode nécessite cependant une certaine pratique pour obtenir des résultats satisfaisants. En outre, les surfaces obtenues sont souvent ondulés et épais, ce qui les rend difficiles à utiliser à faible distance de travail, des lentilles de grande ouverture numérique. Surfaces de mica préparés comme décrit dans ce protocole sont très minces (~ 220 um, y compris l&#39;épaisseur de la lamelle de 170 um) et extrêmement plat, en évitant &quot;ondulation&quot;, ce qui est essentiel pour la réussite de l&#39;imagerie de haute résolution. Ils peuvent être utiliséspour TIRFM ou confocale configurations. De plus, les mêmes échantillons peuvent être transférés à l&#39;AFM, et même imagées simultanément avec TIRFM / confocale et AFM. La combinaison de ces deux techniques permet une corrélation directe du comportement de diffusion avec la structure de membrane à double couche 14. Parce que les surfaces de mica sont fraîchement coupés, ils sont propres et ne nécessitent pas beaucoup de temps, peu reproductible, et les procédures de nettoyage potentiellement dangereuses (protocoles de nettoyage de verre sont habituellement des produits chimiques tels que solution Piranha, l&#39;acide sulfurique, hydroxyde de sodium / potassium). Montage d&#39;une petite chambre, également décrit dans le protocole, de réduire le volume des vésicules nécessaires à la formation de la bicouche efficace à moins de 50 pi. Enfin, l&#39;ensemble du processus de montage de surface n&#39;est pas de temps (préparation prend moins de 30 minutes), et ne nécessite pas un degré élevé d&#39;habileté manuelle, de même que le clivage du mica et de collage classique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="710">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Coverslips 24 x 50mm - No H1.5</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">102222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DOPC</td>
			<td style="width:135px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hellmanex III (detergent)</td>
			<td style="width:135px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">320.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mica V-1 Grade</td>
			<td style="width:135px;">SPI Suppliers</td>
			<td style="width:119px;">1872-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (high viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (low viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sphingomyelin-ATTO647N</td>
			<td style="width:135px;">AttoTec</td>
			<td>AD 647N-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">UV lamp</td>
			<td style="width:135px;">Synoptics Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">GelVue GVM20</td>
			<td>The lamp was set to 100% power</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

Bicouches lipidiques supportées (BLP) sont largement utilisés comme un modèle pour l&#39;étude des propriétés de la membrane (de séparation de phase, regroupement, dynamique) et son interaction avec d&#39;autres composés, tels que des médicaments ou des peptides. Cependant caractéristiques SLB diffèrent selon le support utilisé. Techniques couramment utilisées pour l&#39;imagerie SLB seul et les mesures sont la microscopie de fluorescence de la molécule, FCS et microscopie à force atomique (AFM). Parce que la plupart des études d&#39;imagerie optique sont réalisées sur un support en verre, tandis que l&#39;AFM nécessite une surface extrêmement plate (généralement de mica), les résultats de ces techniques ne peuvent pas être comparés directement, étant donné que les propriétés de charge et la douceur de ces matériaux influencent fortement la diffusion. Malheureusement, le niveau élevé de la dextérité manuelle nécessaire pour le découpage et le collage de fines tranches de mica à la lame de verre présente un obstacle à l&#39;utilisation systématique de mica pour la préparation SLB. Bien que ce serait la méthode de choix, par exemple le mica préparésurfaces finissent souvent par être inégale (ondulé) et difficile à l&#39;image, en particulier avec la petite distance de travail, des lentilles de grande ouverture numérique. Nous présentons ici une méthode simple et reproductible pour la préparation minces, les surfaces de mica plats pour le dépôt de la vésicule lipidique et la préparation SLB. De plus, notre chambre sur mesure ne nécessite que de très petits volumes de vésicules de formation SLB. Les résultats de la procédure globale de la production efficace, simple et peu coûteux de surfaces de bicouche lipidique de haute qualité qui sont directement comparables à celles utilisées dans les études de l&#39;AFM.

Le comportement de diffusion de sondes lipidiques fluorescents dans BLP est différente en fonction du substrat. TIRFM combinée avec la technique SMT est une méthode utile pour visualiser les mouvements de particules et d&#39;extraire leurs coefficients de diffusion. Signaux de molécules simples d&#39;une sonde Sphingomyelin-ATTO647N diffusant dans un DOPC (1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) bicouche supportée sur verre et le mica sont indiqués sur la figure ci-jointe animée. La surface de mica a...

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Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Nous présentons une méthode de préparation de mica soutenu bicouches lipidiques pour microscopie à haute résolution. Mica est transparent et plat à l&#39;échelle atomique, mais rarement utilisé dans l&#39;imagerie en raison des difficultés de manipulation; notre préparation résulte en un dépôt régulier de la feuille de mica, et de réduire la matière utilisée dans la préparation de bicouche.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

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