Name: preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Forfatterne har ingen bekreftelser.

En. Mica og Slides Forberedelse <ol><li> Sted nr 1 ½ (0,17 mm) Dekk inn farging rack. </li><li> Sonicate i 30 minutter i 2% vaskemiddel ved 60 ° C. </li><li> Vask 20 ganger med avionisert vann. </li><li> Fjern lysbilder ved hjelp av pinsett og blås tørt med trykkluft eller nitrogen. </li><li> Skjær glimmer ark i 10 x 10 mm kvadratiske brikker bruker saks eller barberblad. </li><li> Skjær hver glimmer stykke inn 2-3 tynnere brosjyrer ved hjelp av barberblad. MERK: Dette trinnet krever bruk av skarp kniv. <...

<ol>
	<li>Giocondi, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topography+of+membrane+domains.">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li><li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures.">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li><li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+supported+lipid+bilayer+study.">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li><li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers.">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li><li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions.">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li><li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+supported+lipid+bilayers:+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics.">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li><li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av jevne og tynne glimmer overflater for lipid-dobbeltlag avsetning og høy oppløsning. Teknikken krever minimal håndlag, begrenset hovedsakelig til forsiktig demontering av glass-glimmer-glass-sandwich (trinn 2.8), som er kritisk for å oppnå en høy kvalitet glimmer overflate. Inspeksjon av ferskt spaltes glimmer er alltid nødvendig på dette tidspunkt, siden det er mulig for glimmeret til å løsne fra den optiske klebemiddel uten å spalte, slik at u...

Det overordnede målet for den nåværende protokollen er å vise en metode for å forberede glimmer overflater for høyoppløselig avbildning av glimmer støttet lipid dobbeltlag (SLBs) ved hjelp av optisk total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) eller konfokalmikroskopi, som også kan kombineres med atom-kraft mikroskopi (AFM). SLBs er en mye brukt modell for en rekke studier av lipid clustering, faseseparasjon, dynamikk tolagskomponentene eller deres interaksjon med peptider, proteiner eller andre forbindelser 1-5. Forskjellige substrater kan benyttes til SLB-formasjon (dvs. glass, glimmer, silisiumdioksid, polymerer), avhengig av arten av studien 4,6-8. Typiske studier membran avhengige av mikrosbasert avbildningsteknikker, som for eksempel TIRFM og AFM. Således, for TIRFM avbildning, er en glassoverflate et typisk valg fordi glass er gjennomsiktig. Fremstilling av glass er forholdsvis enkel, og kvaliteten av resultatet er først og fremstbestemmes ved grundig overflaterensing før avsetning av lipid-vesikler. AFM på grunn av sin høye aksial oppløsning krever glimmer overflater. Mica er et silikat mineral, med nær perfekt basal cleavage. Således er den ferske spaltes glimmer atomically flat, slik at observasjon av membranhøydeforskjeller selv ved den sub-nanometerskala 9. Diffusjon studier ved hjelp av fremgangsmåter slik som fluorescens-korrelasjonsspektroskopi (FCS), enkelt molekyl sporing (SMT), og fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP) viste imidlertid at lipid membran dynamikk avhenge sterkt av den type overflate hvorpå de er avsatt, hvorved glasset og glimmer kan gi vidt forskjellige resultater 10,11. Disse forskjellene er ikke bare de diffusjonskoeffisienter i membranen, sonder, men også påvisning av separate bestander av partikler Diffusorelementene med ulike priser, og muligens bytte mellom ulike stater. Såledesden direkte sammenligning av resultatene som oppnås ved bruk av TIRFM og AFM teknikker er ofte problematisk, med mindre den samme overflaten (i dette tilfellet glimmer) brukes. Selv om det er noen studier hvor TIRFM og AFM bilags bildebehandling ble gjennomført på samme glimmer overflate 12,13, er glimmer sjelden brukt for optisk mikroskopi, hovedsakelig på grunn av problemer med håndteringen. Mica forberedelse krever skjæring for hånd i tynne hefter, som deretter limt til dekkglass ved hjelp av optisk lim 12. Denne metoden krever imidlertid litt øvelse for å oppnå tilfredsstillende resultater. Videre er de flater som oppnås er ofte bølget og tykk, noe som gjør dem vanskelige å bruke en lav arbeidsavstand, høy numerisk blenderåpning. Mica overflater fremstilt som beskrevet i denne protokollen er svært tynn (~ 220 mikrometer, inkludert dekk tykkelse på 170 mikrometer) og ekstremt flat, unngå &quot;waviness&quot;, noe som er avgjørende for vellykket høy oppløsning. De kan benyttesfor TIRFM eller confocal oppsett. Dessuten kan de samme prøvene bli overført til AFM, og avbildes også samtidig med TIRFM / confocal og AFM. Ved å kombinere disse to teknikkene tillater direkte korrelasjon av diffusjon atferd med dobbeltmembranen struktur 14. Fordi glimmer overflater er ferske kløyvde, de er rene og ikke krever tidkrevende, dårlig reproduserbar, og potensielt farlige rengjøringsprosedyrer (glass rengjøring protokoller inkluderer vanligvis kjemikalier som Piranha løsning, svovelsyre, natrium / kaliumhydroksid). Montering av et lite kammer, som også er beskrevet i protokollen, reduserer volumet av vesikler som kreves for effektiv bilagsdannelse mindre enn 50 pl. Til slutt er hele prosessen med overflateenheten ikke er tidkrevende (fremstillingen tar mindre enn 30 min), og krever ikke en høy grad av manuell dyktighet, og det gjør konvensjonell glimmer spalting og liming.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="710">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Coverslips 24 x 50mm - No H1.5</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">102222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DOPC</td>
			<td style="width:135px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hellmanex III (detergent)</td>
			<td style="width:135px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">320.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mica V-1 Grade</td>
			<td style="width:135px;">SPI Suppliers</td>
			<td style="width:119px;">1872-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (high viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (low viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sphingomyelin-ATTO647N</td>
			<td style="width:135px;">AttoTec</td>
			<td>AD 647N-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">UV lamp</td>
			<td style="width:135px;">Synoptics Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">GelVue GVM20</td>
			<td>The lamp was set to 100% power</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

Støttede lipid bilayers (SLBs) er mye brukt som modell for å studere membranegenskaper (fase separasjon, clustering, dynamikk) og dets interaksjon med andre forbindelser, for eksempel narkotika eller peptider. Men SLB egenskaper varierer avhengig av støtte brukes. Vanlige teknikker for SLB bildebehandling og målinger er enkelt molekyl fluorescens mikroskopi, FCS og atomic force mikroskopi (AFM). Fordi de fleste optiske imaging studier er utført på et glass-støtte, mens AFM krever en ekstremt flat overflate (vanligvis glimmer), kan resultatene fra disse teknikkene ikke sammenlignes direkte, ettersom lade og jevnhet egenskapene til disse materialene sterkt påvirke diffusjon. Dessverre, det høye nivået av manuell dyktighet for skjæring og liming tynne skiver av glimmer til glass-slide presenterer et hinder til rutinemessig bruk av glimmer for SLB forberedelse. Selv om dette ville være den foretrukne metode, for eksempel fremstilt glimmeroverflater ofte ende opp med å bli ujevnt (bølget) og vanskelig å image, spesielt med liten arbeidsavstand, høy numerisk blenderåpning. Her presenterer vi en enkel og reproduserbar metode for å forberede tynne, flate glimmer overflater for lipidvesikkel deponering og SLB forberedelse. I tillegg krever vår skreddersydde kammer bare svært små mengder vesikler for SLB formasjon. Den generelle fremgangsmåte resulterer i en effektiv, enkel og billig produksjon av høykvalitets lipid-dobbeltlag-flater som er direkte sammenlignbare med de som brukes i AFM studier.

Spredningen oppførsel av fluorescerende lipid sonder i SLBs er forskjellig avhengig av underlaget. TIRFM kombinert med SMT teknikken er en verdifull metode for visualisering av partikkelbevegelser og ekstrahere deres diffusjonskoeffisienter. Enkelt molekyl signaler om en Sphingomyelin-ATTO647N probe spre i en DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) bilayer støttes på glass og glimmer er vist på vedlagte animerte figuren. Den glimmer overflate ble fremstilt i henhold til protokollen som er presentert...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Vi presenterer en fremgangsmåte for fremstilling av glimmer støttes lipid-dobbeltlag for høy oppløsning mikroskopi. Glimmer er transparent og flatt på en atomskala, men lite brukt i avbildning på grunn av håndtering av vanskeligheter; vårt preparat resulterer i jevn avsetning av glimmer-ark, og reduserer det materiale som brukes i dobbeltsjikt preparatet.

Utarbeidelse av Mica Støttet Lipid bilayers for High Resolution Optical Mikros Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøven Forberedelse, Imaging, og analyse protokoller for Knife-edge Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband optisk detektor av ultralyd for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

Enkelt Molecule Fluorescensmikroskopi på Planar Støttet bilagene

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Ligand Nano-gruppe Arrays i et støttet lipidbilag

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Byttbar akustisk og optisk oppløsning Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In vivo</em&gt; Små dyr blodprodusering av blodkar

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...