Name: preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00
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Os autores não têm confirmações.

1. Mica e Slides Preparação <ol><li> Lugar No. 1 ½ (0,17 mm) em lamelas suporte de coloração. </li><li> Sonicar durante 30 min em 2% de detergente a 60 ° C. </li><li> Lave 20 vezes com água deionizada. </li><li> Retirar as lâminas usando uma pinça e secar com ar comprimido ou nitrogênio. </li><li> Corte folha mica em 10 x 10 mm pedaços quadrados usando uma tesoura ou lâmina de barbear. </li><li> Corte cada pedaço mica em 2-3 folhetos finas utilizando lâmina de barbear. NOTA: Esta etapa exige o uso...

<ol>
	<li>Giocondi, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topography+of+membrane+domains.">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li><li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures.">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li><li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+supported+lipid+bilayer+study.">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li><li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers.">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li><li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions.">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li><li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+supported+lipid+bilayers:+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics.">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li><li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

Este protocolo descreve um método para a preparação de superfícies lisas e de mica fina para deposição de bicamada lipídica e de alta resolução de imagem. A técnica requer habilidades manuais mínimos, limitado principalmente para a desmontagem cuidadosa do sanduíche vidro-mica-vidro (passo 2.8), que é fundamental para a obtenção de uma superfície de mica de alta qualidade. A inspecção da mica clivada de fresco é sempre necessário, neste ponto, uma vez que é possível para a mica de separar da subst?...

O objetivo geral do presente protocolo é mostrar um método para preparar superfícies de mica em alta resolução de imagem de mica suportada bicamadas lipídicas (EBSL) utilizando microscopia óptica de fluorescência total de reflexão interna (TIRFM) ou microscopia confocal, que também poderia ser combinada com a força atômica microscopia (AFM). EBSL é um modelo amplamente usado para numerosos estudos de agrupamento lipídico, a separação de fases, a dinâmica de componentes de bicamada ou as suas interacções com peptídeos, proteínas ou outros compostos 1-5. Substratos diferentes podem ser usadas para a formação de SLB (isto é, vidro, mica, dióxido de silício, polímeros), dependendo da natureza do estudo 4,6-8. Estudos de membrana típicas contam com técnicas de imagem com base em microscopia, como TIRFM e AFM. Assim, para a imagiologia TIRFM, uma superfície de vidro é uma escolha típica porque o vidro é transparente. Preparação de vidro é relativamente fácil, e a qualidade dos resultados é primariamentedeterminada pela superfície limpeza completa antes da deposição de vesículas lipídicas. AFM, devido à sua alta resolução axial requer superfícies mica. Mica é um mineral de silicato, com cerca de clivagem basal perfeita. Assim, a mica recém clivada é atomicamente plana, permitindo a observação da membrana diferenças de altura, mesmo em escala sub-nanométrica 9. Estudos de difusão, utilizando métodos como a espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), seguindo molécula única (SMT), e recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) mostrou no entanto, que a dinâmica da membrana lipídica depender muito do tipo de superfície sobre a qual são depositados, em que vidro mica e pode dar resultados muito diferentes 10,11. Estas diferenças incluem não apenas os coeficientes de difusão das sondas de membrana, mas também a detecção de populações distintas de partículas que difundem a taxas diferentes, e, possivelmente, a comutação entre os diferentes estados. Assim,a comparação directa dos resultados obtidos utilizando técnicas de TIRFM e AFM é muitas vezes problemática, a menos que a mesma superfície (neste caso, a mica) é usado. Embora existam alguns estudos onde TIRFM e AFM bicamada de imagem foi realizado na mesma superfície mica 12,13, mica é raramente usado para a microscopia óptica, principalmente por causa de problemas de manuseio. Preparação mica requer corte à mão em folhetos finos, que são então coladas à lamela utilizando adesiva óptica 12. Este método, porém, requer um pouco de prática para alcançar resultados satisfatórios. Além disso, as superfícies obtidas são muitas vezes ondulado e grosso, tornando-os difíceis de usar com baixa distância de trabalho, lentes de alta abertura numérica. Mica superfícies preparadas como descrito no presente protocolo são muito finas (~ 220 mM, incluindo a espessura da lamela de 170 um) e extremamente lisa, evitando &quot;ondulação&quot;, o qual é crítico para uma imagem com alta resolução. Eles podem ser utilizadospara TIRFM ou confocal setups. Além disso, as mesmas amostras podem ser transferidos para a AFM, e ainda visualizados simultaneamente com TIRFM / confocal e AFM. A combinação destas duas técnicas permite correlação direta do comportamento de difusão com a estrutura da membrana de bicamada 14. Como as superfícies de mica são recém-clivada, são limpos e não necessitam de demorado, pouco reprodutível, e procedimentos de limpeza potencialmente perigosas (protocolos de limpeza de vidro geralmente incluem produtos químicos como solução Piranha, ácido sulfúrico, hidróxido de sódio / potássio). Montagem de uma pequena câmara, também descrito no protocolo, reduz o volume de vesículas necessários para a formação de bicamada eficaz para menos de 50 ul. Finalmente, todo o processo de montagem de superfície não é demorado (preparação leva menos do que 30 min), e não requerem um elevado grau de habilidade manual, tal como a clivagem de mica convencional e colagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="710">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Coverslips 24 x 50mm - No H1.5</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">102222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DOPC</td>
			<td style="width:135px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hellmanex III (detergent)</td>
			<td style="width:135px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">320.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mica V-1 Grade</td>
			<td style="width:135px;">SPI Suppliers</td>
			<td style="width:119px;">1872-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (high viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (low viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sphingomyelin-ATTO647N</td>
			<td style="width:135px;">AttoTec</td>
			<td>AD 647N-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">UV lamp</td>
			<td style="width:135px;">Synoptics Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">GelVue GVM20</td>
			<td>The lamp was set to 100% power</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

Bicamadas lipídicas suportadas (EBSL) são amplamente utilizados como modelo para o estudo de propriedades da membrana (separação de fases, de agrupamento, dinâmica) e sua interação com outros compostos, tais como drogas ou peptídeos. No entanto características SLB diferente, dependendo do suporte utilizado. Técnicas comumente usados ​​para imagens e medições SLB são microscopia única molécula de fluorescência, FCS e microscopia de força atômica (AFM). Como a maioria dos estudos de imagiologia óptica são realizadas sobre um suporte de vidro, enquanto que a AFM requer uma superfície extremamente lisa (geralmente mica), os resultados destas técnicas não podem ser directamente comparados, uma vez que as propriedades de carga e de suavidade destes materiais influenciam fortemente a difusão. Infelizmente, o nível elevado de destreza manual necessária para o corte e colagem de fatias finas de mica para a lâmina de vidro apresenta um obstáculo para a utilização de rotina de mica para a preparação SLB. Embora este seja o método de escolha, tal mica preparadasuperfícies muitas vezes acabam por ser irregular (ondulado) e difícil de imagem, especialmente com distância de trabalho pequeno, lentes de alta abertura numérica. Aqui apresentamos um método simples e reprodutível para preparar superfícies planas finas de mica para a deposição de vesícula lipídica e preparação SLB. Além disso, a nossa câmara personalizado feito requer apenas pequenas quantidades de vesículas para a formação SLB. Os resultados do procedimento geral para a produção eficiente, simples e barata de alta qualidade superfícies da bicamada lipídica, que são directamente comparáveis ​​com os utilizados em estudos de AFM.

O comportamento de difusão de sondas fluorescentes lipídicas em EBSL é diferente, dependendo do substrato. TIRFM combinada com a técnica SMT é um método valioso para a visualização de movimentos de partículas e extrair os seus coeficientes de difusão. Sinais de moléculas isoladas de uma sonda de esfingomielina-ATTO647N difusão numa DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) em bicamada suportada em vidro e de mica são mostrados na figura animada em anexo. A superfície de mica foi preparado de ac...

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Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Apresenta-se um método de preparação de mica suportado bicamadas lipídicas para microscopia de alta resolução. Mica é transparente e liso em uma escala atômica, mas raramente usado em imagiologia por causa de dificuldades de manuseio; a preparação resulta em deposição uniforme da folha de mica, e reduz o material usado na preparação de bicamada.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

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