Name: osteoclast derivation from mouse bone marrow
Uploaded: 2014-11-06T14:00:00
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Agradecemos o apoio do NIH concede R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, a Fundação Oak eo Laboratório Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.

NOTA: Declaração de Ética: Toda pesquisa envolvendo animais vertebrados foi realizada em termos dos protocolos aprovados pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC). 1. Preparação <ol><li> Permitir 10 ml de disponíveis comercialmente meios de separação de gradiente de densidade celular (que contém polissacarose e diatrizoato de sódio, ajustada a uma densidade de 1,077 g / ml) de vir até à temperatura ambiente num tubo de 50 ml. </li><li> Prepare a citometria de fluxo (FACS...

<ol>
	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. 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The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

Uma habilidade para isolar facilmente e cultivar um grande número de osteoclastos in vitro tem sido responsável por ajudar a avançar na compreensão da biologia óssea e doenças mediadas por osteoclastos. Foi a identificação de RANKL que levam a este, quando foi recentemente identificado como o principal regulador da formação de osteoclastos, diferenciação e sobrevivência de 16-18. Tem sido nossa experiência que o cultivo in vitro de osteoclastos de m...

A remodelação óssea é dinâmico e envolve o acoplamento de formação óssea com reabsorção óssea 1. Este processo fortemente regulado é responsável por manter o esqueleto durante a homeostase normal, e em resposta a lesões e doenças. Os osteoclastos são células únicas, multinucleadas, que são capazes de reabsorção ambas as matrizes orgânicos e inorgânicos dos ossos. Os osteoclastos são derivadas da linhagem monócito / macrófago de medula óssea 2-5. As anormalidades na função ou a formação de osteoclastos pode resultar numa variedade de patologias, incluindo condições clínicas comuns, como a osteoporose. A capacidade de gerar osteoclastos in vitro tem permitido avanços significativos em nossa compreensão da biologia óssea 6. Como resultado, os novos agentes terapêuticos estão a emergir para tratar doenças relacionadas com osteoclastos que são responsáveis ​​pela morbilidades e mortalidades significativas 7 </sacima&gt;. Manutenção homeostática da massa óssea e força exige a acção concertada dos osteoblastos da formação óssea e osteoclastos de reabsorção óssea 8,9. Homeostase óssea é modificado de uma série de doenças, incluindo a osteoporose pós-menopausa, em que o aumento da actividade de osteoclastos levando à perda de massa óssea patogénico e densidade de 10. Com o aumento da disponibilidade de modelos murinos transgénicos de doença humana, há mais oportunidade para decifrar o papel dos osteoclastos na doença óssea humana 11-13. Inúmeros protocolos para técnicas de cultura de osteoclastos aparecem na literatura, com muitas variações descritas 9,12,14. Xing e colegas descrevem uma metodologia semelhante para o protocolo descrito abaixo, na descrição de ensaios osteoclastogênicos a partir de células de medula óssea de murino. No entanto, para libertar as células de medula óssea seguintes colheita de osso longo, Xing et al. Lave a cavidade da medula com α-MEM meio completo14. Catalfamo examina o efeito da hiperglicemia em função dos osteoclastos e descreve um método em que todas as células mobilizadas pela lavagem da medula óssea são cultivadas durante 24 horas, altura em que as células não-aderentes são descartados 12, uma técnica também usada por Boyle et ai . 9 Estes protocolos previamente publicados exigem a prática de lavagem da medula óssea, uma prática tedioso, que também introduz o risco de um ferimento por picada de agulha e perda de medula óssea valiosa, pois é necessário cortar ambas as extremidades do osso. O protocolo, que descrevemos, implementa a utilização de um almofariz e pilão para isolar os osteoclastos, que é semelhante ao processo de isolamento descrito por macrófagos Weischenfeldt et al 15. A nossa experiência, contudo, é que o isolamento dos osteoclastos e da cultura in vitro usando técnicas de resultados anteriormente publicados nos resultados variáveis ​​em termos de produção de osteoclastos, muitas vezes resultandona impossibilidade de cultivar osteoclastos. Por conseguinte, temos desenvolvido um protocolo que permite o isolamento consistente de medula óssea de ratinho para produzir um grande número de osteoclastos in vitro, multinucleadas, com um rendimento aproximado de 70-80% das células plaqueadas inicialmente formando macrófagos e, subsequentemente, osteoclastos, na presença de meio de indução de osteoclastos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Os osteoclastos são células altamente especializadas que são derivados a partir da linhagem monócito / macrófago de medula óssea. A sua capacidade única para reabsorver tanto as matrizes orgânicas e inorgânicas de osso significa que eles desempenham um papel fundamental na regulação da remodelação esquelética. Juntos, osteoblastos e osteoclastos são responsáveis ​​pelo processo de acoplamento dinâmico que envolve tanto a reabsorção óssea e formação óssea agindo em conjunto para manter o esqueleto normal durante a saúde e na doença. À medida que a célula de reabsorção óssea principais no corpo, alterações na diferenciação de osteoclastos ou a função pode resultar em efeitos profundos no corpo. Doenças associadas com a função dos osteoclastos alterada pode variar em gravidade de doença neonatal letal devido a falha para formar um espaço de medula para a hematopoiese, a patologias como a osteoporose, na qual excessiva reabsorção óssea osteoclástica predispõe à fratura formação mais comumente observada. ent &quot;&gt; A capacidade de isolar os osteoclastos em números elevados in vitro tem permitido avanços significativos na compreensão do ciclo de remodelação óssea e abriu o caminho para a descoberta de novas estratégias terapêuticas que combatam essas doenças. Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolar e cultivar osteoclastos da medula óssea do rato que irá produzir um grande número de osteoclastos.

<html> O objectivo deste método foi isolar facilmente um grande número de osteoclastos in vitro, tipicamente em uma semana. Isolamento bem sucedido de um grande número de osteoclastos foi confirmada utilizando a coloração da fosfatase ácida resistente ao tartarato (Figura 1A). Grandes osteoclastos são visualizados como grandes células roxas com múltiplos núcleos (tipicamente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, é comum para isolar osteoclastos com até 30 núcleos por osteoclastos ...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

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Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

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Dinâmica de formação de propulato de plantas de medula óssea fresca

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...