Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00
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This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. Synthèse de 10 nm nanoparticules d&#39;or (Gold IP) 15 <ol><li> Préparer la solution A: ajouter 2 ml aqueuse à 1% de chlorure d&#39;or dans 160 ml Milli-Q, ou double distillée, eau. </li><li> Préparer la solution B: ajouter 8 ml 1% de tri-citrate de sodium x 2 H 2 O et l&#39;acide tannique 160 pi de 1% dans 32 ml Milli-Q, ou double distillée, eau. </li><li> Réchauffer la solution A et B à 60 ° C et les mélanger en remuant. Observez immédiatement une couleur bleu foncé. Observez la ...

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. 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A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. 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Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

Le système endo-lysosomal de cellules de mammifère contrôle les processus physiologiques importants, y compris l&#39;absorption des nutriments, l&#39;hormone de la transduction du signal à médiation par, la surveillance immunitaire et la présentation de l&#39;antigène 17. Jusqu&#39;à présent, divers marqueurs ont été utilisés pour le marquage des études de la voie d&#39;endocytose et de suivi. Par exemple, les sondes sont des sondes d&#39;Lysotracker acidotropic fluorescents mis au point par Mole...

Nanoparticules fluorescentes (IP), y compris IP métalliques, points quantiques, IP, IP polymères de silice, des points de carbone, etc., ont attiré une attention considérable au cours des dernières décennies 1,2. Par rapport à des colorants organiques traditionnels, les IP fluorescents montrent chimiques, des propriétés optiques et mécaniques souhaitables, telles que la résistance forte du signal, la résistance au photoblanchiment et haut de 3,4 biocompatibilité. Ces avantages en font la méthode de choix pour la détection intracellulaire et imagerie des cellules vivantes. En outre, une variété de IP denses aux électrons sont visibles en microscopie électronique (EM), ce qui facilite leur utilisation pour l&#39;analyse microscopique corrélée, qui permet combinaison de suivi en microscopie optique (LM) et une résolution supérieure au niveau ultrastructural avec EM 5 cellules vivantes. Par exemple, les IP or ont été longtemps utilisé efficacement comme biocapteurs pour le diagnostic dans les cellules sensibles vie ainsi que dans le domaine de l&#39;immuno-marquage 6. S récentses études indiquent que les IP or avec la taille et de forme différentes peuvent être facilement absorption par une grande variété de lignées de cellules et de transporter régulièrement par la voie endosomale, ont donc grand potentiel étant appliquée pour le suivi du transport des vésicules intracellulaires et l&#39;étiquetage du système endo-lysosomale 7,8 . Les pathogènes microbiens, tels que Salmonella enterica, Shigella flexneri et Listeria monocytogenes, ont développé des mécanismes différents pour envahir les cellules hôtes non-phagocytaires neuf. Après avoir été intériorisé, les agents pathogènes, soit localisées dans le cytosol ou séquestrés dans les compartiments membranaires, interagissent beaucoup avec leur environnement d&#39;accueil et les moduler pour favoriser leur propre survie 10. Par exemple, Salmonella enterica réside et se multiplie dans un phagosome intracellulaire appelé la vacuole contenant Salmonella (SCV) lors de l&#39;infection 11. Le SCV maturationtrafics vers l&#39;appareil de Golgi, subissant interactions continues avec la voie d&#39;endocytose, et induit la formation de vastes structures tubulaires, tels que Salmonella filaments induites (SIF), le tri tubules nexine, Salmonella induite porteuses de sécrétion des protéines de la membrane 3 (SCAMP3) tubules, etc. . 12-14. Étudier comment ces agents pathogènes bactériens manipuler voies cellule hôte est essentielle pour comprendre les maladies infectieuses. Ici, NP or-BSA-rhodamine ont été utilisés comme marqueurs de fluide pour marquer le système endo-lysosomal cellulaire hôte et l&#39;agent pathogène gastro-intestinal Salmonella enterica sérovar Typhimurium humain (Salmonella) a été utilisé comme une bactérie modèle pour étudier les interactions de l&#39;agent pathogène avec le accueillir voie d&#39;endocytose. Intracellulaires IP or BSA-rhodamine dans les cellules et les cellules non infectées infectés par Salmonella WT ou souches mutantes ont été imagées par un microscope confocal à balayage laser (CLSM).Puis logiciels Imaris a été utilisée pour quantifier la distribution des IP, ce qui indique que l&#39;infection à Salmonella induit extrême réarrangement des endosomes / lysosomes. Après la description de cette méthode, des expériences analogues peuvent être conçus pour suivre devenir à long terme des IP intériorisés et d&#39;étudier l&#39;influence de diverses substances exogènes ou facteurs endogènes sur la voie d&#39;endocytose des cellules eucaryotes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Nanoparticules fluorescentes (IP) avec des propriétés optiques et mécaniques et chimiques souhaitables, sont des outils prometteurs pour étiqueter organites intracellulaires. Ici, nous introduisons une méthode utilisant or-BSA-rhodamine IP d&#39;étiqueter le système de cellules eucaryotes endo-lysosomale et surveiller manipulations des voies cellulaires de l&#39;hôte par le pathogène intracellulaire Salmonella enterica. Les IP ont été facilement internalisées par les cellules HeLa et localisées à la fin des endosomes / lysosomes. Infection à Salmonella réarrangement des vésicules et l&#39;accumulation des IP dans les structures membranaires Salmonelle induites induit. Nous avons déployé le progiciel Imaris pour des analyses quantitatives des images de microscopie confocale. Le nombre d&#39;objets et de leur distribution de taille dans les cellules non infectées étaient distinctes de celles dans les cellules infectées par Salmonella, indique une très remodelage du système endo-lysosomale par WT Salmonella.

IP or ont été générés par une méthode bien établie par la réduction de l&#39;acide chloroaurique par le citrate et l&#39;acide tannique. Comme le montre la Figure 2A, les PN synthétisés or étaient quasi-sphérique avec une taille d&#39;environ 10 nm. BSA-revêtement et de la rhodamine-étiquetage ne ​​ont pas d&#39;influence sur la morphologie ou la taille (figure 2B). Il a été rapporté que les IP or peuvent être facilement absorbés par d...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Cet article décrit les méthodes pour la synthèse et le marquage fluorescent de nanoparticules (NP). Les IP ont été appliquées dans des expériences pulse-chase d&#39;étiqueter le système endo-lysosomale des cellules eucaryotes. La manipulation du système d&#39;endo-lysosomal par les activités de l&#39;agent pathogène intracellulaire Salmonella enterica ont été suivis par imagerie des cellules vivantes et quantifiée.

Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

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