Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. Syntese av 10 nm Gold Nanopartikler (Gold NPs) 15 <ol><li> Forbered løsning A: tilsett 2 ml 1% vandig gull klorid i 160 ml Milli-Q, eller dobbelt destillert vann. </li><li> Forbered oppløsning B: Tilsett 8 ml 1% tri-natriumcitrat x 2 H2O og 160 pl 1% Garvesyre i 32 ml Milli-Q eller dobbelt-destillert, vann. </li><li> Varm opp løsning A og B til 60 ° C og bland dem under omrøring. Observere en mørk blå farge umiddelbart. Observere rød farge etter ca 15 min. Deretter varmes opp til 95 °...

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticles+for+intracellular+sensing:+a+review.">Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).</li><li>Wu, C., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+fluorescent+semiconducting+polymer+dots+for+biology+and+medicine.">Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles:+an+era+in+bionanotechnology.">Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).</li><li>Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. Microbiol. 2, 125 (2011).</li><li>Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+the+endosomal+system+during+formation+of+Salmonella-induced+filaments+by+intracellular+Salmonella+enterica.">Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica.</a> Traffic. 9, 2100-2116 (2008).</li><li>Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella-induced+tubular+networks.">Salmonella-induced tubular networks.</a> Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).</li><li>Zhang, Y., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticles+as+endocytic+tracers+in+cellular+microbiology.">Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology.</a> Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).</li><li>Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+22.">Chapter 22.</a> Cell Biology. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).</li><li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking.">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

Endo-lysosomal system av pattedyrceller styrer viktige fysiologiske prosesser, herunder næringsopptak, hormon-mediert signaltransduksjon, immun overvåking, og antigenpresentasjon 17. Opp til nå, har en rekke markører vært brukt til merking av endocytoseveien og sporing studier. For eksempel, LysoTracker sonder er fluorescerende acidotropic prober utviklet av molekylære prober (Life Technologies, USA) for lysosome merking, som kan selektivt akkumuleres i mobilnettet lommer med lav indre pH og effektivt e...

Fluorescent nanopartikler (NPS), inkludert metall NPs, kvanteprikker, polymer NPs, silika NPs, karbon punktum, etc., har vakt betydelig oppmerksomhet i løpet av de siste tiårene 1,2. Sammenlignet med tradisjonelle organiske fargestoffer, fluorescerende NPs viser ønskelig kjemiske, optiske og mekaniske egenskaper, som for eksempel sterk signalstyrke, motstand mot fotobleking og høy biokompatibilitet 3,4. Disse fordelene gjør dem metoden for valg for intracellulær sensing og levende celle bildebehandling. Videre en rekke elektrontette NPs er synlige ved elektronmikroskopi (EM), tilrettelegging for deres bruk for korrelert mikroskopisk analyse, som tillater kombinasjon av levende celle sporing med lysmikroskopi (LM) og høyere oppløsning på ultrastructural nivå med EM 5. For eksempel har gull NPS vært lang tid effektivt anvendes som biosensorer i levende celler for sensitiv diagnostisering så vel som i felten av immun-merking 6. Nylige studies indikerer at gull NPS med forskjellig størrelse og form kan være lett opptak av et stort utvalg av cellelinjer og rutinemessig transporteres gjennom endosomale veien, har derfor et stort potensial som påføres for intracellulær transport vesikkel sporing og systemet merking endo-7,8 lysosomal . Mikrobielle patogener, som Salmonella ente, Shigella flexneri og Listeria monocytogenes, har utviklet ulike mekanismer for å invadere ikke-fagocyttiske vertsceller 9. Etter å ha blitt internalisert, patogener, enten lokalisert i cytosol eller inne i de membranbundne avdelinger, samhandle mye med sine vertsmiljøer og modulere disse til å favorisere sin egen overlevelse 10. For eksempel ligger Salmonella ente og replikerer innenfor en intracellulær phagosomal rommet kalt Salmonella-holdige vakuole (SCV) ved infeksjon 11. Modning SCVtraffics mot Golgi-apparatet, gjennomgår kontinuerlige interaksjoner med endocytoseveien, og induserer dannelsen av omfattende rørformede strukturer, slik som Salmonella indusert filamenter (SIF), sortering nexin tubuli, Salmonella -indusert sekretorisk carrier membran protein 3 (SCAMP3) tubuli, etc . 12-14. Studere hvordan disse bakterielle patogener manipulere vertscelle veier er viktig for forståelse av smittsomme sykdommer. Her ble gull-BSA-rhodamin NPS anvendt som fluid tracere for å merke vertscelle endo-lysosomal systemet, og den humane mage-patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) ble anvendt som en modell for å studere bakterie interaksjoner av patogenet med vert endocytoseveien. Intracellulære gull-BSA-NPs i ikke-infiserte celler og celler infisert med WT Salmonella eller mutantstammer ble fotografert av et konfokal laser-scanning mikroskop (CLSM).Deretter Imaris programvare ble benyttet for å kvantifisere fordelingen av NPS, noe som viser at Salmonella-infeksjon indusert ekstrem omleiring av endosomer / lysosomer. Etter beskrivelsen av denne metoden, kan analoge eksperimenter være utformet for å spore langvarig skjebnen til de internalis NPS og for å undersøke innflytelsen av forskjellige eksogene stoffer eller endogene faktorer på endocytoseveien av eukaryote celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Fluorescent nanopartikler (NPS) med ønskelig kjemiske, optiske og mekaniske egenskaper er lovende verktøy å merke intracellulære organeller. Her introduserer vi en metode med gull-BSA-NPs å merke endo-lysosomal system av eukaryote celler og overvåke manipulasjoner av vertscelle pathways av den intracellulære patogen Salmonella ente. NPS ble lett internalisert av HeLa celler og lokalisert i sene endosomer / lysosomer. Salmonella infeksjon indusert omorganisering av blemmer og opphopning av NPs i Salmonella- indusert membranstrukturer. Vi rullet ut Imaris programvarepakke for kvantitative analyser av konfokalmikroskopi bilder. Antall objekter og deres distribusjons størrelse i ikke-infiserte celler var forskjellig fra de i Salmonella -infected celler, noe som indikerer ekstremt ombygging av endo-lysosomal system av WT Salmonella.

Gull NPs ble generert gjennom en veletablert metode via reduksjon av chloroauric syre ved citrate og garvesyre. Som vist i figur 2A, de syntetiserte gull NPS var kvasi-sfærisk form med en størrelse på ca 10 nm. BSA-belegg og rodamin-merking ikke påvirke deres morfologi eller størrelse (figur 2B). Det har blitt rapportert at gull NPs kan lett tas opp av ulike pattedyrceller og endte opp i endocytiske systemer 7. I samsvar med tidligere arbeide...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Denne artikkelen beskriver fremgangsmåter for syntese og fluorescerende merking av nanopartikler (NPS). NPS ble brukt i puls-chase eksperimenter å merke endo-lysosomal system av eukaryote celler. Manipulering av endo-lysosomal system av aktiviteter av den intracellulære patogen Salmonella ente ble etterfulgt av levende celle bildebehandling og kvantifisert.

Anvendelse av Fluorescent Nanopartikler å studere Omforming av det Endo-lysosomal System av intracellulære bakterier

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex Påvisning av bakterier i Complex Clinical and Environmental Prøver å bruke oligonukleotid-coupled Fluorescent Mikrokuler

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Rensing og Visualisering av lipopolysakkarid fra Gram-negative bakterier ved Hot Vandig-fenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Encellete Målinger av vacuolar Rupture forårsaket av intracellulære patogener

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Funn av nye Intracellulære patogener ved Amoebal coculture og Amoebal berikelse Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Utvikling av en økonomisk DNA leveringssystem &quot;Acufection&quot; og dens anvendelse i Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Effekt og Cytotoksisitet Screening av inhibitorer målretting Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisere intracellulær SNARE smugling av fluorescens levetid Imaging mikroskopi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman mater-fritt System for masseproduksjon av Murine naturlige drepe celler In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...