Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00
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This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. Síntese de 10 nm Nanopartículas de Ouro (Gold PN) 15 <ol><li> Preparar a solução A: adicionar 2 ml 1% de cloreto de ouro aquosa para 160 ml Milli-Q, ou bidestilada, água. </li><li> Preparar a solução B: adicionar 8 mL de 1% de tri-citrato de sódio x 2 H2O e ácido tânico 160 ul de 1% em 32 ml de Milli-Q, ou duas vezes destilada, água. </li><li> Aquecer a solução A e B a 60 ° C e misturá-los com agitação. Observe a cor azul escuro imediatamente. Observe cor vermelha depois de ce...

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. 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A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. 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C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+22.">Chapter 22.</a> Cell Biology. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).</li><li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking.">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

O sistema de endo-lisossômico de células de mamíferos controla processos fisiológicos importantes, incluindo a absorção de nutrientes, transdução de sinal mediadas por hormônios masculinos, vigilância imunológica, e apresentação de antígenos 17. Até agora, uma grande variedade de marcadores foram utilizados para a rotulagem das vias de endocitose e estudos de rastreio. Por exemplo, as sondas Lysotracker são sondas fluorescentes acidotropic desenvolvidos pela Molecular Probes (Life Technologies...

Nanopartículas fluorescentes (PN), incluindo NPs metálicas, pontos quânticos, o NPS de polímero, o NPS de sílica, pontos de carbono, etc., têm atraído uma atenção considerável nas últimas décadas 1,2. Em comparação com os corantes orgânicos tradicionais, NPs fluorescentes mostram químicas, propriedades ópticas e mecânicas desejáveis, tais como a potência do sinal forte, a resistência à fotodegradação e elevada biocompatibilidade 3,4. Essas vantagens tornam o método de escolha para a detecção intracelular e imagens de células vivas. Além disso, uma variedade de NPs elétron-densas são visíveis por microscopia eletrônica (ME), facilitando a sua utilização para análise microscópica correlacionada, que permite combinação de células vivas de rastreamento com microscopia de luz (ML) e maior resolução em nível ultra-estrutural com EM 5. Por exemplo, NPs de ouro têm sido desde há muito tempo utilizado de forma eficiente em células como biossensores para o diagnóstico sensível vivo, bem como no domínio da imuno-6 de rotulagem. S recentestudies indicam que nanopartículas de ouro com diferentes tamanhos e formas podem ser facilmente captação por uma grande variedade de linhas de células e transporte de rotina, através da via endossomal, por conseguinte, ter grande potencial de ser aplicada para o transporte intracelular de seguimento da vesícula e do sistema de rotulagem de endo-7,8 lisossomal . Os agentes patogénicos microbianos, tais como Salmonella enterica, Shigella flexneri e histeria monocytogenes, têm desenvolvido diversos mecanismos para invadir as células hospedeiras não fagocíticas 9. Depois de ser internalizado, os agentes patogénicos, quer localizadas no citosol ou sequestrados nos compartimentos ligados à membrana, interage bastante com os seus ambientes de hospedeiro e modulam estes favorecem a sua própria sobrevivência 10. Por exemplo, Salmonella enterica reside e replica dentro de um compartimento phagosomal intracelular denominada -contendo vacúolo Salmonella (SCV) por infecção 11. O SCV amadurecimentotrafega em direção ao aparelho de Golgi, passando por interações contínuas com a via endocítica, e induz a formação de estruturas tubulares extensas, tais como Salmonella filamentos induzidas (SIF), seleção túbulos nexin, Salmonella transportadora secretora induzida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc . 12-14. Estudar como estas bactérias patogênicas manipular vias de células do hospedeiro é essencial para a compreensão de doenças infecciosas. Aqui, NPs de ouro-BSA-rodamina foram utilizados como marcadores de fluido para rotular o sistema celular hospedeiro endo-lisossomal, e o agente patogénico humano gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) foi utilizado como um modelo de bactéria para estudar as interacções entre o agente patogénico com o hospedar via endocítica. NPs de ouro-BSA-rodamina intracelulares em células não infectadas e células infectadas com WT ou estirpes mutantes de Salmonella foram fotografadas por um microscópio de varrimento a laser confocal (CLSM).Então Imaris software foi utilizado para quantificar a distribuição de NPs, indicando que a infecção por Salmonella induzida extremo rearranjo dos endossomas / lisossomas. Seguindo a descrição do presente método, as experiências análogas pode ser concebido para controlar destino a longo prazo das NPs internalizadas e para investigar a influência de várias substâncias exógenas ou factores endógenos na via endocítica de células eucarióticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Nanopartículas fluorescentes (PN), com desejável propriedades ópticas e mecânicas química, são ferramentas promissoras para rotular organelas intracelulares. Aqui, apresentamos um método que utiliza ouro-BSA-rodamina NPs para rotular o sistema de endo-lisossômico de células eucarióticas e monitorar manipulações de acolhimento vias celulares pelo patógeno intracelular Salmonella enterica. As NPs foram prontamente internalizado pelas células HeLa e localizadas em endossomos tardios / lisossomos. Infecção por Salmonella induzida rearranjo das vesículas e acúmulo de NPs em estruturas de membrana Salmonella- induzidas. Implantamos o pacote de software Imaris para análises quantitativas de imagens de microscopia confocal. O número de objetos e sua distribuição de tamanho em células não infectadas eram distintas das que estão em células infectados por Salmonella, indicando extremamente remodelação do sistema de endo-lysosomal por WT Salmonella.

NPs de ouro foram gerados por meio de um método bem estabelecido através da redução de ácido cloroáurico por citrato e ácido tânico. Como mostrado na Figura 2A, as NPs de ouro foram sintetizados quase-esféricas com um tamanho de aproximadamente 10 nm. BSA-revestimento e rotulagem rhodamine não influenciou sua morfologia ou tamanho (Figura 2B). Tem sido relatado que NPs de ouro pode ser prontamente retirado pelas várias células de mamífero e term...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Este artigo descreve métodos para a síntese e marcação fluorescente de nanopartículas (PN). As NPs foram aplicados em experiências de pulse-chase para rotular o sistema de endo-lisossomal de células eucarióticas. A manipulação do sistema de endo-lisossomal por actividades do agente patogénico intracelular, Salmonella enterica foram seguidas de imagem de células vivas e quantificada.

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

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