Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. Síntesis de 10 nm nanopartículas de oro (Gold PN) 15 <ol><li> Preparar la solución A: añadir cloruro de oro acuosa 2 ml 1% en 160 ml Milli-Q, o doblemente destilada, agua. </li><li> Preparar la solución B: añadir 8 ml 1% tri-citrato de sodio x 2 H 2 O y ácido tánico 160 l 1% en 32 ml Milli-Q, o doble destilada, agua. </li><li> Calentar la solución A y B a 60 ° C y se mezclan con agitación. Observar un color azul oscuro de inmediato. Observe el color rojo después de unos 15 minutos....

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticles+for+intracellular+sensing:+a+review.">Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).</li><li>Wu, C., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+fluorescent+semiconducting+polymer+dots+for+biology+and+medicine.">Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles:+an+era+in+bionanotechnology.">Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).</li><li>Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. Microbiol. 2, 125 (2011).</li><li>Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+the+endosomal+system+during+formation+of+Salmonella-induced+filaments+by+intracellular+Salmonella+enterica.">Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica.</a> Traffic. 9, 2100-2116 (2008).</li><li>Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella-induced+tubular+networks.">Salmonella-induced tubular networks.</a> Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).</li><li>Zhang, Y., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticles+as+endocytic+tracers+in+cellular+microbiology.">Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology.</a> Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).</li><li>Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+22.">Chapter 22.</a> Cell Biology. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).</li><li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking.">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

El sistema de endo-lisosomal de las células de mamíferos controles importantes procesos fisiológicos, incluyendo la absorción de nutrientes, la transducción de señales mediada por la hormona, la vigilancia inmune, y la presentación de antígeno 17. Hasta ahora, una variedad de marcadores se han utilizado para el etiquetado de los estudios de la vía endocítica y seguimiento. Por ejemplo, las sondas son sondas LysoTracker acidotropic fluorescentes desarrollados por Molecular Probes (Life Technologies, ...

Nanopartículas fluorescentes (PN), incluidos los PN de metal, puntos cuánticos, polímeros PN, PN sílice, puntos de carbono, etc., han atraído una atención considerable durante las últimas décadas 1,2. En comparación con los tintes orgánicos tradicionales, NPs fluorescentes muestran propiedades químicas deseables, ópticas y mecánicas, tales como fuerte intensidad de la señal, la resistencia a photobleaching y alta biocompatibilidad 3,4. Estas ventajas que el método de elección para la detección intracelular y imágenes de células vivas hacen. Además, una variedad de NPs electrón-densos son visibles por microscopía electrónica (EM), facilitando su uso para el análisis microscópico correlacionada, que permite la combinación de células vivas de seguimiento con microscopía de luz (LM) y mayor resolución a nivel ultraestructural con EM 5. Por ejemplo, los NPs de oro han sido mucho tiempo utilizado eficientemente como biosensores en células sensibles para el diagnóstico de vida, así como en el campo de la inmuno-etiquetado 6. S recientesos estudios indican que NP de oro con diferente tamaño y forma pueden ser fácilmente captación por una gran variedad de líneas celulares y transportar de forma rutinaria a través de la vía endosomal, por lo tanto tienen un gran potencial de ser aplicado para el seguimiento de la vesícula de transporte intracelular y el sistema de etiquetado endo-7,8 lisosomal . Patógenos microbianos, como Salmonella enterica, Shigella flexneri y Listeria monocytogenes, se han desarrollado diferentes mecanismos para invadir las células huésped no fagocíticas 9. Después de ser interiorizado, los agentes patógenos, ya sean localizadas en el citosol o secuestradas en compartimentos de membrana, interactuando con su entorno de acogida y modulan estos para favorecer su propia supervivencia 10. Por ejemplo, Salmonella enterica reside y se replica dentro de un compartimiento intracelular phagosomal denomina -Con vacuola Salmonella (SCV) después de la infección 11. El SCV maduracióntráficos hacia el aparato de Golgi, sufriendo continuas interacciones con la vía endocítica, e induce la formación de estructuras tubulares extensos, tales como Salmonella filamentos inducidos (SIF), clasificación túbulos nexina, Salmonella portadoras secretora inducida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc. . 12-14. Estudiando cómo estos patógenos bacterianos manipulan las vías de la célula huésped es esencial para la comprensión de las enfermedades infecciosas. Aquí, NPs de oro-BSA-rodamina fueron utilizados como trazadores de fluidos para etiquetar el sistema de endo-lisosomal celular del huésped, y el patógeno gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium humana (Salmonella) se utilizó como un modelo de bacteria para estudiar las interacciones del patógeno con la acoger vía endocítica. PN oro-BSA-rodamina intracelular en las células no infectadas y las células infectadas con WT Salmonella o cepas mutantes se obtuvieron imágenes de un microscopio de escaneo láser confocal (CLSM).Entonces software Imaris se utilizó para cuantificar la distribución de los NPs, lo que indica que la infección por Salmonella inducida reordenamiento extremo de los endosomas / lisosomas. Después de la descripción de este método, los experimentos análogos pueden ser diseñados para rastrear el destino a largo plazo de los NPs internalizadas y para investigar la influencia de diferentes sustancias exógenas o factores endógenos en la vía endocítica de las células eucariotas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Nanopartículas fluorescentes (PN) con química deseable, propiedades ópticas y mecánicas son herramientas prometedoras para etiquetar orgánulos intracelulares. Aquí, presentamos un método que utiliza oro-BSA-rodamina PN para etiquetar el sistema endo-lisosomal de las células eucariotas y supervisar la manipulación de las vías celulares de acogida por el patógeno intracelular Salmonella enterica. Los parlamentos nacionales se internalizan fácilmente por las células HeLa y localizados en endosomas tardíos / lisosomas. Infección por Salmonella indujo reordenamiento de las vesículas y la acumulación de los PN en estructuras de membrana Salmonella inducidos. Desplegamos el paquete de software Imaris para análisis cuantitativos de imágenes de microscopía confocal. El número de objetos y su distribución de tamaño en las células no infectadas eran distintos de los de las células infectadas por Salmonella, lo que indica extremadamente remodelación del sistema de endo-lisosomal por WT Salmonella.

NP de oro se han generado a través de un método bien establecido a través de la reducción del ácido cloroaúrico por el citrato y ácido tánico. Como se muestra en la Figura 2A, los NPs de oro sintetizados eran casi de forma esférica con un tamaño de aproximadamente 10 nm. BSA-recubrimiento y rodamina-etiquetado no influyeron en su morfología o tamaño (Figura 2B). Se ha informado de que NPs de oro pueden ser fácilmente absorbidos por las diversas ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Investigación

Inmunología e Infección

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por &quot;Acufection&quot; y su aplicación a la investigación de la piel

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...