Name: a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos
Uploaded: 2014-11-08T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
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这项工作是由下列资金的温格特研究实验室的支持：美国国立卫生研究院授予K01 DK083512，DP2 OD008470和R01 DK100237;出生缺陷基金会巴兹尔·奥康纳入门学者给予奖励＃5 FY12-75的;开始从科学和生物科学系的圣母院书院的大学资金;和丰盛的礼物圣母大学的伊丽莎白和迈克尔·加拉格尔代表加拉格尔家庭，以促进干细胞研究。在资助者在研究设计，数据收集和分析，发布的决定，或准备的手稿没有任何作用。我们感谢保罗T.克勒格尔，小对稿件提供重要的反馈。我们感谢生物科学部的工作人员的支持，而中心的斑马鱼研究在巴黎圣母院为他们在我们的斑马鱼群体的照顾和福利的杰出贡献。最后，我们要感谢我们的resear成员CH实验室对这项工作的意见，进行讨论和见解。

该程序在这里描述的斑马鱼工作在Notre Dame大学被批准的实验动物管理和使用委员会。的研究设计的导向为在斑马鱼本说明书小分子屏幕设置（ 图1）。在这个协议中所描述的方法的概述被提供为一个流程图（ 图2）。请参考示例标记系统（ 图3）来计划部件4-10中描述的胚胎处理步骤。对胚胎的分期，请参阅斑马鱼分段系列40，和用于制备在零件9-10使用WISH反义核糖核酸探针，指最近发表的方法41。 1.准备斑马鱼交配商会<ol><li>将一个成年男性斑马鱼和一个成年雌性斑马鱼成交配室，由室分O / N分开。 注：质量交配，这样的š那些使用组2-3雌性和雄性2-3相比单一配对交配能产生更多的胚胎，并且可以与适当大小的配合腔室中进行。 </li><li>重复步骤1.1中，使得总共25对斑马鱼的是设置为每96孔板的小分子，将被测试。 </li></ol> 2.收集斑马鱼胚胎<ol><li>第二天，删除分隔每条鱼对分频器和1小时后，用细网过滤收集斑马鱼胚胎，并将其放置在含有E3胚胎培养基（见配方物料清单）的培养皿。 注：收集胚胎后1小时可确保胚胎正处于相似的发展阶段。 </li><li>使用塑料移液管，以清除杂物（ 如食品和固体废弃物）。接下来，使用立体显微镜，观察胚胎的各离合器和删除任何未受精的卵子。 </li><li>倒出的E3胚胎培养基，换上新鲜的E3，然后将每个迪SH在28.5℃培养箱中培养胚胎。 2小时后观察使用立体显微镜胚胎各离合器和删除任何未受精的卵子。 注：未受精的卵子会毒害其他胚胎，并似乎在单细胞阶段或不透明。 </li><li>继续监测胚胎的使用立体显微镜，直到他们达到40％外包的发展进步。观察看起来在40％外包阶段40所组成的两个单独的层的胚胎的球体形状。 </li></ol> 3.化学稀释准备<ol><li>除去化学文库板从存储在-80℃下，用铝箔覆盖，并在室温下解冻。 注：不同的库将在解冻主要取决于溶剂不同速率被使用。通常情况下，冷冻于-80℃的化学品库将完全在大约3小时，在室温解冻。商店解冻板（S）在一个安全的位置，与相应的危险品标签。穿ppropriate眼镜，实验室外套，和处理化学药品时，两套手套。 </li><li>使用一个8通道多通道移液管加入99微升的E3成列的96孔板的2-12。 注意：根据我们的经验，合适的起始药物的范围是介于10微米- 50微米，并且还作为在当前的协议39进行说明。在这里，我们展示了一个10微米的治疗，如果采用1毫米的化学库中的股票板块。 </li><li>使用一个8通道多通道移液管加入1μl的各化合物的其各自的井与E3。 </li><li>使用P10到吸管1微升DMSO中（或适当的溶剂中）到控制列（在此为第12列）。 </li><li>覆盖化学稀释板用铝箔，作为铝箔会保护在库中的任何光敏化合物，并在库存化学文库板返回到-80℃下贮存。 </li></ol> 4，组阵斑马鱼胚胎<ol><li>选择一个培养皿含斑马鱼胚胎在40％外包阶段。使用移液管小心地放入大约10胚的（1.1毫升）中的每个孔深孔96孔板内。分配胚胎成列的深96孔板的2-12。 注：研究者应该选择最好适合他们希望询问的发展过程中药品加成的时间点。使用塑料移液管，可最大限度地减少胚胎停育。由于药物治疗之前，40％的外包可能会导致增加胚胎致死，发展胚胎再之前的药物暴露，尤其是当后来的发展进程正在审查。放置超过15-20胚胎在每个孔可导致发育迟缓由于拥挤而应当避免。值得注意的是，深96孔板中含有胚胎是来自化学稀释的96孔板的不同是很重要的。 </li><li>使用玻璃移液管从每个很好地去除多余的E3，排出多余的E3成液体废物容器。 注：此过程通常需要30分钟到1小时根据研究者的速度，因此胚胎是在50％和60％的外包被完成，这是因为除了在这里所描述的化学稀释的目标发展阶段。该板可以在45°角倾斜，以使胚胎下降到井的底部，以使移液管的尖端可以针对井的底部被压吸去多余的E3。 </li></ol> 5.添加化学处理的<ol><li>使用一个8通道多道移液器在深96孔板中含排列的斑马鱼胚胎中加入100μl稀释化学品转移到他们各自的水井。 注：请确保该化合物的原井位，在相应的深96孔板（ 例如 ，在化学稀释板B1井位被吸取到B1井位在深的井位匹配96孔板）。 </li><li>湿纸巾，把它变成一个感光容器足够大，可以容纳96孔板。 注：湿纸巾将有助于防止化学品稀释液蒸发。 </li><li>接下来，使用密封垫密封深96孔板，将其放入感光容器中，在28.5℃的孵化了。 注：让斑马鱼的胚胎发育，直到第二天早上。或者，使胚胎发育直到用于过程中的适当的发育阶段被分析。 </li></ol> 6.去除化学品<ol><li>使用一个8通道多通道移液管加入300微升的E3对药物处理的孔中的每一行。抽出，并丢弃从每排的E3 /化学稀释。用300微升E3洗胚胎3次。 注：丢弃药物浪费在仅用于该目的的标记的容器。为了便于洗涤的，用充满E3玻璃盆足够宽，能够使用MULTichannel吸管。 </li></ol> 7.链霉蛋白酶和固定斑马鱼胚胎<ol><li>传输使用塑料移液管斑马鱼胚胎成4个24孔板中，然后取出所有死胚。标记24孔板中，使它们对应于原药以及位置。发生在一个黑暗的背景前移液器每孔转移后以可视化的吸管的胚胎，防止胚胎以及交叉。 </li><li>使用塑料移液管吸去E3以便将胚勉强浸没在液体中。 </li><li>使用玻璃吸管〜2滴的链霉蛋白酶的股票（50毫克/毫升）添加到每个孔中。让胚培养在链霉蛋白酶处理5分钟，然后搅拌该孔中，以使绒毛掰开。备选地，链霉蛋白酶的胚胎它们在用于分析所需的发育阶段之前。 </li><li>使用塑料移液管与E3洗两次胚胎。 </li><li>一旦胚胎是在分析中，排版所需阶段letely抽出并丢弃其余的E3。 </li><li>使用塑料移液管添加新鲜的4％PFA / PBS中，以每个孔中。孵化的胚胎在4°CO / N来解决。用刚解冻的PFA初步修复的胚胎。 注：继续执行您感兴趣的屏幕检测。这里详细介绍第8-10是一个过程来处理筛板与心愿。可供选择的方法，可以被取代的如需要的话，然后进行第11节和评估结果。 </li></ol> 8.胚胎通透<ol><li>使用塑料移液管，以排出物的4％PFA / PBS中的胚胎，并用1×两次洗涤胚胎（磷酸盐缓冲盐水与吐温）的PBST。胚胎转移到48孔板中，然后从胚胎抽出的1×PBST中。标记48孔板中，以匹配深96孔板的原井的位置。 </li><li>用塑料移液管吸取，然后它关闭，并添加100％methano添加100％甲醇的洗井升再次向胚胎。 </li><li>将胚胎在-20℃下，孵育至少20分钟。可替换地，保持在100％甲醇中的胚胎，在-20℃下长期储存。 </li><li>除去100％的甲醇中并用50％甲醇/ 1×PBST中，然后在30％甲醇/ 1×PBST洗涤胚胎，最后两次用1×PBST中。 注：胚胎年龄超过24小时，受精后（高倍视野）可以在此时被漂白以除去色素39。 </li><li>加入15微升的解冻蛋白酶K的库存（10毫克/毫升）至50ml 1×PBST中以制备蛋白酶K（5微克/毫升）的工作溶液。 </li><li>从胚胎中取出1×PBST中，并添加蛋白酶K工作溶液。 4分钟后取出蛋白酶K。 注：实验者应在该步骤中，以防止胚胎降解迅速工作。蛋白酶K的浓度和温育时间需要根据胚胎的年龄被处理41来改变。这里所述的参数涉及胚胎这是24 HPF。 </li><li>洗1X PBST胚胎，再加入冰冷的4％PFA / PBS。让胚胎孵育在4％PFA / PBS中20分钟，在RT。 </li></ol> 9.杂交和探针移除<ol><li>使用玻璃移液管取出4％PFA / PBS和1X PBST洗两次胚胎。替换为1倍的PBST用500μlHYB +的孵育胚胎4小时，在70℃。 注意：预杂交可为少至2小时来进行的，但4小时是理想的。此外，不同的杂交和洗涤温度可以是适合于特定的探针，例如65℃，但在个人基础上应进行测试。 </li><li>生成对应于感兴趣41的基因（多个）地高辛标记的核糖核酸探针。 </li><li>加入16微克核糖核酸探针来16毫升HYB +的。在使用前预先温热的核糖核酸探针/ HYB +溶液在70℃下进行至少20分钟。如果使用多个探针，每个探针加16微克到相同的HYB +卷（16毫升）中。 </li><li>使用玻璃移液管，去除HYB +，并使用P1000上添加200微升的核糖核酸探针/ HYB +混合物。倒置核糖核酸探针/ HYB +鸡尾酒使用和吸管起来之前和之后加入该混合物到每个孔中向下一次。使用屏障枪头添加核糖核酸探针/ HYB +解决方案，这样可以防止混合气进入吸管。 </li><li>孵育中的核糖核酸探针/ HYB +鸡尾酒的胚胎在70°CO / N。使用的粘合剂膜，以覆盖板孔的O / N探针保温和以下所有热洗涤的。 </li><li>准备50％甲酰胺/ 2×SSCT，2个SSCT和0.2X SSCT和预暖在70°CO / N。 </li><li>使用P1000，除去核糖核酸探针/ HYB +和在-20℃下将混合物储存。 （可选），再使用多达三倍的riboprobe / HYB +混合。之前，每个重复使用，在3微克核糖核酸探针的添加到原始riboprOBE / HYB +混合。 </li><li>用玻璃移液管，两次，用50％甲酰胺/ 2×SSCT在70℃下洗涤胚胎30分钟。一旦用2×SSCT 15分钟，在70℃下洗涤胚胎。在70℃下用0.2×SSCT两次洗涤胚胎30分钟。取出0.2×SSCT并在室温洗MABT胚胎的两倍。 </li></ol> 10.抗地高辛抗体孵育和检测<ol><li>使用玻璃移液管，从每个孔中取出MABT。使用塑料移液管中，添加新鲜块溶液到每个孔中。让胚胎在孵育块4小时在室温。加入8μl的抗洋地黄毒苷抗体的40毫升块溶液（5000倍稀释）。 </li><li>使用塑料移液管，代替与抗体/块解块溶液。添加足够的抗体/块溶液完全覆盖胚胎。 </li><li>覆盖48孔平板用铝箔，使得没有光可以通过穿透到细胞胚。公司乌瓦特胚胎O / N在4℃。用玻璃移液管，取出抗体/块溶液和洗涤胚胎10次MABT为每次5-10分钟。 注：MABT洗液可以连续地进行，因为它会采取研究者5-10分钟，从各板去除MABT和分配清新MABT入井。 </li><li>生成的预染色缓冲液以40ml（80毫升数量）两个管。添加180微升的NBT（50毫克/毫升）和140μl的BCIP（50毫克/毫升），以预染色缓冲液制备的管中的一个来创建该染色溶液。 注：此染色溶液将产生紫色着色基板。 </li><li>代替预染色缓冲的MABT并让胚在室温下孵育5分钟。 </li><li>更换预染色缓冲液用染色溶液，并在室温离开。监测比色反应用立体显微镜每15分钟。 注：染色反应可以从几分钟到取决于探头许多小时。 </li><li>众议员花边用1×PBST将染色溶液后的染色反应完成，然后用1×PBST洗两次胚胎5分钟。 </li><li>取出1X PBST并添加4％PFA / PBS固定的胚胎。 注意：可替换地，执行双WISH检测核糖核酸探针的标记与抗荧光素抗体。如果执行双重原位 ，则跳过加入1×PBST洗涤（步骤10.8）在4％PFA / PBS中（步骤10.9）中并用MABT洗涤用0.1M甘油洗两次胚胎15分钟，两次，每次15分钟，然后孵化的胚胎在块30分钟。然后使用正确的染色液中添加了正确的抗体，O / N和执行步骤10.3-10.9。为了检测荧光素标记的核糖体探针，制备具有BCIP和INT染色液，观察红色衬底（参见步骤10.1）。 </li></ol> 11.计分的化学屏幕胚胎板<ol><li>使用立体显微镜来评估胚胎SAMPL执行结果的视觉评分ES在表型检测。 </li><li>使用塑料移液管，从48孔板转移胚胎到12孔板上以获得最佳的可视化。标记12孔板中，使它们对应于从原来的深96孔平板中的井位。当传输完成后，查看了体视显微镜下。 注：代表性的胚胎可以从12孔平板中进行选择，并在盖玻片41成象在载玻片上。 </li></ol>

作者什么都没有透露。

化学遗传学在斑马鱼可以在药物开发的进展至关重要的影响。该协议提供了一个手动的高通量方法与WISH读出进行化学遗传学在斑马鱼胚胎，有效地实现个人或小团队进行小分子的屏幕。这个最小的资源方法扩展化学遗传学的许多研究小组的可行性。具体而言，该屏幕战略提供了使用机器人的仪器的一个重要选择，因为这样的系统没有得到广泛的研究跨部门的访问。本手册的屏幕使得单个个体测试一个96孔板化合物在为期6天的工作周一个愿望读出。因为斑马鱼是卵生，与胚胎显影母体以外，和胚胎是足够大，可以看到用肉眼（1-3毫米之间），它们是适合于人工搬运用简单的手段和研究人员在罐阵列样品多孔板，而无需使用显微镜。此外，因为斑马鱼的迅速发展，小分子接触，可以有效使用单次治疗的化合物，而不是反复给药，其最小化进一步的手工处理。斑马鱼的胚胎很容易培养，因为他们的卵黄提供营养高达5-6天受精后，消除了鱼苗饲养的复杂性的根源。此外，大多数幼虫器官已经开发并在此期间，它提供了研究的研究问题各种各样的机会成为功能。通过简单地增加小分子对胚胎孵化介质是非侵入性的并且允许研究者（S）以选择对药物剂量，添加时间，和持续时间的曝光，从而提供了严格的控制，许多变量，并允许为特定的发育过程感兴趣的进行查询。如这里描述的，显著研究生产率可在短timefr来实现AME使用本手册屏幕的方法。根据我们的经验，存在对被投资努力的高回报，这可以通过使用已知的生物活性化学品库来分析的兴趣，如肾发育过程中肾单位分割的处理来突出（ 图4; Poureetezadi和格特，未发表）。 这里所描述的人工化学的屏幕是非常灵活的，因为它涉及到固定斑马鱼标本的检测。例如，该策略可以修改在一个星期内，以测试多个板的化合物，然后得分胚胎随后一周。上固定的斑马鱼样品的替代测定法，如免疫组织化学或其他组织染色制剂，也可取代的WISH读出。实验策略来执行在斑马鱼细胞测定是适应由于早期发育阶段的光学清晰度和透明度。此外，研究人员可以在以后STA抑制色素沉着使用的化学品水电站或避免颜料发展的复杂共通过使用颜料较少遗传线条像的casper或纯粹的斑马鱼13。它是手动管理的小分子是可行的，处理所关注的污点（s）和手动评分使用简单的实体显微镜的胚胎。然而，必须记住，可以进行自动图像分析是很重要的，而且实际上可能需要高分辨率的表型分析。例如，它可能是优选的伴侣的自动图像分析系统具有直接测定中，如转基因记者，因为这简化了样品的手工处理，量化的差异并不明显，以肉眼观察，并消除了研究者的偏置15。幸运的是，一些自动成像系统均为用户友好和经济的软件费用15项。使用和其他自动化系统的能力得到了迅速发展，并能可用于定向的生物，管理药物治疗，甚至搬迁有机体12,15。这些自动化系统已经预示着一个新的研究的科技时代，并提供创新的解决方案来处理大量的考试科目，从而进行高通量筛选和HCS方法在整个生物体12,15。虽然这样的机器是无可否认的有用的工具，他们也非常昂贵，是遥不可及的许多基础研究实验室。如果无法访问这些自动化的功能它可能看起来化学屏幕是不可能的。然而，该协议概括了如何进行，可用于完成化学遗传学屏幕在一个实用的方法在一个合理的时间周期的说明画面的导向。 缺点为在一般手动筛选和化学遗传学存在，并考虑到一个化学屏幕时应当牢记。特别是，这里展示的方法需要适度身体灵巧。这种关注是减弱或通过重复完全排除了，因为手巧将改善与实践。另外，存在最小的空间显着误差，因为有每孔只10的胚胎进行分析。小分子可以在被诱导的表型的外显率会发生变化，因此，合理的治疗方案的得分，以确定感兴趣的必须遵循的化合物。至关重要的是，利用这个协议的研究人员设计出合适的严格标准，他们会考虑一击。同样重要的是要记住，这种形式的画面的性质，将最有可能产生假阳性，其可通过进一步的化学工作式划定的某一部分。另外，关键是要精确地阶段的胚胎，并收集离合器用于筛选受精后不久，由于异步发展可导致并发症的准确评估的药物治疗的效果。此外，在关于化学品的筛选作为一个前perimental策略，有许多局限性。化合物的溶解度和载体分子的毒性（ 例如，二甲亚砜（DMSO）），也提出了一个问题，并且可能是令人望而却步的测试许多分子。绒毛膜还可以充当屏障的药物暴露。最后，即使斑马鱼是一个功能强大的和翻译模型化学遗传学，护理应始终采取在确定是否另一种化学屏幕的策略， 例如，使用体外系统，如细 ​​胞系，可用于替代使用的全动物。然而，在整个斑马鱼系统的化学处理被认为是优选的，以进行类似的方法在哺乳动物中，因为它提供了一种收集所述化合物的全身效应的优点，并且能够使研究人员以分流化合物在哺乳动物模型进行测试列表。 迄今为止，斑马鱼化工屏幕提供了一个有力的实验工具Tø描绘发展的机制，以及确定候选药剂用于药物中，如能防止疾病病理的分子的鉴定。例如，一项研究烧伤和同事使用在心肌42表达GFP的转基因斑马鱼胚胎中开发了自动微穴试验对心脏速率。他们用这种转基因株系，分析心脏速率发展，它是如何影响对药物治疗42。另一项研究，通过测试的造血干细胞在斑马鱼胚胎的人口密度，确定了前列腺素E2调节HSC利基23。这一发现在小鼠进行了验证，并为后来的临床试验在人类脐带移植23,31-33（NIH临床Trials.gov，NCT00890500; NCT01627314）来实现。通过近来的一些研究，化学遗传学已被证明是在使用斑马鱼研究肾脏疾病有用<s高达&gt; 43。斑马鱼的肾脏提供了一个很好的范例来研究nephrogenesis或肾单位再生，即在开发和急性肾损伤43包括肾脏的功能单位。肾单位结构的斑马鱼胚胎肾和 ​​成年哺乳动物肾44-50之间是高度保守的。几项研究审查斑马鱼胚胎肾清楚地说明加上化学遗传学在其固有的平移潜力。化学遗传学屏幕上被映射到基因PKD2和ift172，这是已知的关键人物多囊肾（PKD）34两个斑马鱼突变体进行。屏幕导致识别泛组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（TSA），其为小分子，其可能抵消形态缺陷通常出现在突变体胚胎。一种不同的方法采取的德格罗和他的同事筛选了INDUC化合物编水肿在野生型斑马鱼胚胎，这表明在肾功能35的破坏。识别PTBA作为命中后，他们观察到，除了引起水肿，PTBA也增加pax2a的表达，一个标记为肾祖细胞。重要的是，PTBA的优化衍生物，然后显示出减少的接受庆大霉素引起的肾损害，此外，加速了肾功能损害27蒙受小鼠的恢复成年斑马鱼的百分比死亡。两者合计，这些贡献来自斑马鱼的化学遗传学展示的发现，可以使用在此协议中描述的方法制成的类型。 而化学遗传学研究带有实质性的好处，但是它也存在一定的挑战。仅仅使用化学遗传学方法可使其复杂化，以确定特定的基因或基因正受到的化合物。即使靶（多个）被发现，一斯gnificant间隙可以保持化合物的鉴定和理解的行动，其中所述小分子的行为的机制（多个）之间。例如，它可以是难以确定的，其中的小分子充当因为单一化合物能够具有一定范围的有机体中的不同作用机制。然而，随着新技术和多种化学遗传筛选的出现正在完成在斑马鱼中，确定一个机构的问题是缩小。一种方法中，以帮助确定鉴定的化合物的分子效应是选择已知的生物活性物质的筛选，其中的机制可以潜在地从先前注释的数据推导出的药物库。此外，chemoinformatic算法，如发现门，可用于使用可与之比较的化合物数据库的化合物的结构相似性以赋予机构14。另一种方法来阐明化合物的机制将是产生一个磁墨字符识别oarray处理后的配置文件，然后在查询的芯片药物配置文件，如连接地图编辑此配置文件，搜索机制上定义的化合物引起类似的效果14。这种方法也可用于识别具有类似的效果作为感兴趣的化合物的基因的突变体。找到的化合物和其突变体之间的连接可能表明，该化合物分子工程上游或相关的基因，它可以通过用所述化合物和吗啉代的突变体被圈定的下游。另一种选择是质谱法，这是继续成为斑马鱼更加优化。此方法可用于描绘的药物治疗后的特定蛋白质的改变或翻译后修饰。最后，小分子，甚至是整个图书馆有时能够被标记为具有约束力的合作伙伴拉了下来。还值得一提的，虽然如何小分子功能的机制，我显著进口S，还有FDA批准的药物用于其机制尚不清楚。 虽然斑马鱼表现出遗传性和生理上有许多相似之处于哺乳动物，还有药物交叉14的问题。从在斑马鱼胚胎50的画面为细胞周期抑制剂一项研究调查了命中的交叉能力。屏幕造成14命中，以前未知的具有细胞周期活动的标识。这些14的化合物，6，发现有细胞周期活动在人类和斑马鱼细胞培养测定，3被证明是血清灭活在细胞培养试验中，1是有源仅在斑马鱼细胞，4无活性的任一斑马鱼或人细胞培养试验，但仅在斑马鱼整个生物体。值得注意的是，4种化合物，只有具有活性，在斑马鱼中证明有斑马鱼和哺乳动物可能prohi之间的差异位的某些化合物的平移潜力。这是要注意到，但有小分子的例子，如PGE 2，它放大的造血干细胞在人类接受者和PTBA衍生物改善肾功能恢复的哺乳动物的速率灌输的能力，从而提供了证明的一个重要考虑原则是交叉是可能23,31-33。 无论这些缺陷，化学遗传学，这最小的资源方式有很大优势的研究领域。化学遗传学是在斑马鱼特别有用的，并将继续在分子途径的询问和药物开发中发挥重要作用。基于离散的分子靶点的化学屏幕在历史上一直受故障率高，由于所谓的吸收，分布，代谢，排泄和毒性（ADMET）特性51的星座图。利用斑马鱼化工屏幕专注于一个过程，而不是一个独立的目标，可以绕过几个ADMET问题，并确定是有效的，在整个生物体的上下文化合物。与现有的斑马鱼的研究，包括目前的突变株，并利用基因组编辑创建有针对性的基因突变和转基因的能力，资源的日益池，有几乎用斑马鱼潜在的化学遗传筛选的无限数量。许多化学库已经策划和跨度收藏与已知的生物活性物质，新的化合物，结构多样，结构相似。这些试剂的屏幕组合是目前已经上市，有可能进一步增长，在未来几年提供了丰富的令人兴奋的机会。有了这些准备，这本手册和高通量协议提供，以增加研究团体的能力，利用斑马鱼进行化学遗传学筛选实用的和用户友好的方式。

的有效治疗药物的身份来治疗人类疾病的残局许多生物医学研究人员。而潜在的药理学试剂的临床应用的鉴定和表征具有用于医疗明显的价值，它仍然是一个显著挑战。最终，许多治疗性化合物的发展来自于特定的细胞类型无论是如何发展和功能的认识。斑马鱼， 斑马鱼 ，是鲤科 ，已成为发育生物学1主流模式生物的淡水硬骨。斑马鱼的基因听话的脊椎动物，易于维护和操作的科学研究2,3。斑马鱼的胚胎是透明的，从外部受精，并且可以由几百个从单个成人交配对中仅一个星期2,3来制备。此外，斑马鱼的份额主要器官系统，并拥有庞大的ðegree遗传相似性的哺乳动物（包括人）4。引人注目的是，人类的基因有70％斑马鱼同源基因4。由于这种相似性，斑马鱼是一个高度相关的实验系统，用于研究脊椎动物发育和生理机制，并且已经被用来概括多种人类疾病5-7中。由于这些原因，除其他外，已取得了斑马鱼的理想候选基因继续盘问，并导致对斑马鱼的效用在生物医学研究6,7稳步增加赞赏。 在过去的几十年中，遗传工具的丰富，已经开发了斑马鱼。斑马鱼的基因组中是适合于诱变和转基因3。迄今为止，过多的正向和反向遗传学研究已经完成，导致超过9000的突变体3的生成。此外，大量的转基因株系都可以烯形成，其已经启用的特定细胞类型3的标签和隔离。已经有显著不断努力，集中和分配这些资源，以研究界，这对于实验室的访问通过国际斑马鱼资源中心（齐尔茨）8一个相当低的成本。此外，生物信息与分子工具，从基因表达模式来吗啉序列和协议的广泛的信息库，已逐步诠释了斑马鱼信息网（ZFIN）9-11上。这些斑马鱼研究的基础设施已经成为可能，通过显著NIH的支持和宣传这种动物模型8。斑马鱼突变，转基因株系，以及相关信息的这种缓存仍然是物超所值的生物学研究社区。然而，在斑马鱼现在是一个成熟的和卓越的模式生物，它们代表了拉rgely尚未开发的油藏，以通过利用化学遗传筛选的研究发育生物学和疾病。 化学遗传学是利用小分子，如药物或其他化合物，以活系统12内影响生物学过程。化学遗传学可实施来了解基因功能的分子机制，比如，以确定药剂的救援或加剧的特定遗传缺陷12。此外，化学遗传学代表一个主要途径进行转化研究12。而传统的正向遗传学筛选动物模型已经非常强大的连接特定的基因疾病，他们缺乏一个时间维度，使困难或有时无法观察会出现术后早期胚胎的表型的。此外，基因冗余可以使从正向遗传学观察到的结果难以解释。另外，化学遗传学筛选允许精细的时间控制，同时提供了一个有价值的起点药物发现12,13。 化学遗传学可以使用体外系统（ 例如，细胞系，蛋白质）或使用体内系统，来执行诸如整个生物体。使用体外系统中进行化学遗传学可能是有益的，因为它是简单的比整个有机体系统，更容易的工作与大规模，成本更低，并且更短的时间密集的。其结果是， 在体外系统允许两个高通量筛选（HTS）和高含量筛选（HCS）。有许多优点，以使用体外系统接近化学遗传学时应当考虑的，但也显著局限性。一个主要限制使用的细胞系是，小分子可以是有效的和无毒的在特​​定细胞系，但成为有毒时引入整个生物体。因此，关键问题之一是， 在体外系统中不捕获生物的广泛的范围内，因此，不总是能够准确地模拟在整个有机体发生了什么。而在整个生物体的化合物的测试可以避开这些问题，使用哺乳动物的全生物体模型带来了一些物理和伦理限制。例如，在小鼠中的药物筛选通过测定需要足够的样本大小的空间和费用是逻辑上的阻碍。此外，发育的问题是很困难的研究，由于这一事实，即哺乳动物发育在子宫内 。最后，尽管生物医学研究的开展具有巨大的社会价值，但是人们还是大量的需求，限制剧烈的研究，减轻疼痛和痛苦用于研究的动物保护动物福利。斑马鱼提供了一种可行的替代品，以用象哺乳类高级脊椎动物的工作，而且，许多主题可以使用化学遗传学在被研究胚胎和幼虫阶段时神经处理是不存在或可操作在较低水平12,13。 到目前为止，已经使用斑马鱼胚胎中的特定化学品进行遗传筛选无数，如复合交付可以通过浸入含利息12-15药物胚胎媒体来完成。此外，已经有不少的科技进步，使化学遗传学筛选可能的和可管理16-20。 Peterson和同事们首先使用斑马鱼在化学遗传学的屏幕在2000年，后来在2004年确定了抑制主动脉缩窄突变的斑马鱼21,22的化合物。化学画面，至今已实施数个研究开发组织（ 如心脏，血液，血管）23-25，生理功能（ 例如，行为神经学基础）26，成人再生27,28，和diseas<html> E型（ 例如，肌肉萎缩症和癌症）29,30。从这些斑马鱼化工屏幕，前列腺素调节造血干细胞的发现已被带到人体临床试验，证明从移动“坦克到床边”的权力23,31-33（NIH临床Trials.gov，NCT00890500; NCT01627314）。最近，有前途的候选治疗药物已经出现了复杂的器官，如肾脏，它在修复多囊肾（PKD）34和急性肾损伤27,35细胞病理学，虽然这些还没有移动到临床试验。这些化学遗传筛选大致表明在显影斑马鱼和应用化学遗传学来询问成年组织的功能的能力测试小的化合物的效用。此外，存在的市售药理学集合可用于学术研究19日益列表。 ove_content“&gt;在过去的几年中，出现了在化学遗传筛查技术突出的进步，包括使用机器人的自动化系统的药物分配和处理，以及自动成像系统36-38。这种系统允许的可能性测试化合物数千个同时实现高通量筛选和HCS 36-38。不幸的是，化学遗传学筛选与这些机器人创新企业的承诺通常需要相当多的资源，这些资源类型是一个显著的障碍对于很多缺乏资金收购机构，操作和维护等仪器。同时建立了自动化处理的化学库，包括胚胎转移到阵列板的基础设施建设，保持高昂的成本对于许多实验室，自动成像和分析一般比较接近12。自动图像筛选能够定量荧光的转基因重搬运工和促进特定表型分析12,15。 虽然自动化系统代表有用的技术进步，许多问题可以通过更集中手动屏幕来解决，如几千生物活性化合物在发育过程中的原位杂交（WISH），读出39查询与整体式安装。此外，虽然越来越多的实验室已援引斑马鱼化学屏幕来调查研究问题，很少（如果有的话）的努力已达到饱和，许多主题还没有使用化学遗传学被攻破。化学屏幕可以使用一个小的斑马鱼细胞集落仅由几个野生型或转基因罐被执行。因此，这种形式的遗传讯问应达到通过有意拓展/多样化到这个舞台上最斑马鱼的研究小组。不同大小的化学库，可以从商业分销商和/或COL采购laborators。由于这些原因，化学遗传学可以是即使在恶劣的气候条件下的资金在经济上可行。不过，也有障碍开 ​​头的化学遗传学的屏幕，比如如何规划屏幕的后勤方面： 例如，需要一个成功的银幕人员的数量，专门的时间和拼凑配股一起物理协议手工工艺样本这个数字从几百到几千。在这里，我们详细地手动高通量协议与愿望作为读出执行中的斑马鱼胚胎的化学遗传学。此方法涉及药物治疗的斑马鱼胚胎中，接着核糖核酸探针检测的mRNA转录物。使用此协议，一个小团队，甚至一个人可以合理筛选和分析一个温和的化学库大约有600化合物在9周的跨度。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:252px;">JoVE 51922 MATERIALS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:252px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 - 10 &#965;L natural pipet tips</td>
			<td style="width:191px;">USA Scientific</td>
			<td>1111-3800</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 50X E3 and DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB11072</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-3225</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">20X SSC</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB13156</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td>35-3226</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs - boil then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plate</td>
			<td style="width:191px;">CytoOne</td>
			<td>CC7672-7548</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">50 X E3</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 deep well plate</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>100-11-940</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate sealing mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-946</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B8503</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mg/mL using 100% DMF - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">block solution</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00448</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 &#176;C. (Keep unused BSA flakes at 4 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:349px;">Consult the manufacturer procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00450</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">4716728001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-1005</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epT.I.P.S 20-300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>22492284</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">E7023</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16140089</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430516</td>
			<td style="width:349px;">0.45 &#965;m CA / 1L volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">fine forceps</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:101px;">RS-1050</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:252px;">Formamide</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00600</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass basin 90 x 50</td>
			<td>Kimax Kimble</td>
			<td>23000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass pipette</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glass vial</td>
			<td style="width:191px;">Wheaton</td>
			<td style="width:101px;">225012</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycerol</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G7893</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G8898</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycogen</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">HYB+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 &#965;L/&#965;L heparin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">INT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">I8377</td>
			<td style="width:349px;">Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:252px;">MAB</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MABT</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in MAB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MeOH</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">34860-4L</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:191px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:101px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:191px;">Mediatech</td>
			<td style="width:101px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 0.5 - 10 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.019</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 30 - 300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.051</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">nanodrop</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">NBT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">N6876</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:101px;">19210</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR-Film adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>30127.48</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plate container (Pencil Box)</td>
			<td style="width:191px;">Sterilite</td>
			<td>1722</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pronase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11459643001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3335399001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">rubber bulb</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-22</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11487671001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 45 &#965;L of NBT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 31.5 &#965;L of INT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon</td>
			<td style="width:101px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11031171001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10881775001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:191px;">Samco</td>
			<td style="width:101px;">202, 204</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB02038</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:252px;">waterbath</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">51221073</td>
			<td style="width:349px;">(Model # 2831)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos

斑马鱼已成为一种广泛使用的模式生物调查所依据发育生物学机制，来研究人类疾病的病理，由于其相当程度的遗传保护与人类。化学遗传学限嗣继承测试的生物学过程，大意是小分子已经和正在成为一种流行的翻译研究方法，以确定治疗性化合物。斑马鱼特别吸引人的用于，因为它们能够提供透明的胚胎，它是外部受精的大离合器能力的化学遗传学。此外，斑马鱼的胚胎可以很容易地通过药物的简单加的化合物对胚胎媒体的处理。 原位杂交（WISH），使用整个安装，mRNA的表达可清晰显示斑马鱼胚胎中。总之，利用化学遗传学和心愿，斑马鱼成为其中确定的细胞和生理的有力整个生物体环境小分子的影响。创新已经取得进展在于利用机为基础的筛选程序的技术，然而对于许多实验室这样的选项是不可访问或保持成本高昂。这里所描述的协议说明如何执行需要的基本资源，并且可以通过一个单一的个人或小组中的时间的有效周期来完成一个人工高通量化学遗传筛选。因此，该协议提供了一种可行的策略，可以通过研究组实现对斑马鱼进行化学遗传学，其可以是为获得基本见解发育过程，疾病的机理是有用的，并识别具有医学相关的应用程序的新的化合物和信号通路。

此处所描述的手动的方法允许单个研究者有效地和顺利进行的高通量小分子化学遗传学筛选使用斑马鱼胚胎模型（ 图1）。使用这种方法，这是实用的单人对其进行化学遗传学屏幕，以使得在9周的过程中一人（致力于一个40小时工作周）可进行的〜600的化合物的调查（ 图1） 。因此，一个人的长椅时间可以绕过需要高资源要求的设备，如自动系统。权衡是一个手动屏幕需要几个星期的专用努力。与此相反，使用自动化系统可以压缩牵涉到1-2周的机器人时的时间，并且可能需要相对最小的研究者努力整体。增加一个手动屏幕的效率和/或范围的一种方法是争取2-3研究者总共，这将使m的筛选矿化合物，不同的化合物浓度，和/或筛选在更短的时间周期。 涉及的协议来完成在斑马鱼胚胎中的化学遗传学屏用WISH读出的主要步骤被示为流程图（ 图2）。实验任务可以被划分成两种类型的工作周的：（1）化学暴露和胚胎的标签，和（2）分析和成像。在化学品接触的工作周，这些步骤包括（建立斑马鱼成人（第1天），胚胎收集，胚胎排列和药物治疗（2日）， 原位杂交准备胚胎（3日），并在原位杂交4日-6）。在分析/影像周，研究人员分析基因表达的得分胚胎和图像命中（7-11日）。 进行化学遗传学屏幕的一个重要组成部分，是坚持和准确地标注好地点。作为化学遗传学画面process详述此处涉及将套胚胎从一个井在一个板到一个井在不同的板多次，需要精确和清晰的标签是非常重要的，这样，当一个化学命中拿下它可以是直线状，容易追溯到到的化学库中的标识（ 图3）。一种简单的方法来确保这是在这样一种方式，在任何时间以及位置为一组由化合物处理的胚胎的直接匹配用于治疗那些胚胎的化合物的化学药物库板以及定位标记板（ 图3）。在这里，彩色编码和数值标签的双系统用于组织样品，其中加入到使用永久标记（ 图3）的网屏板。 在分析的高通量筛选的结果，有一个关键需要开发一种方法，以正确地组织，注释和分析潜在的小分子命中。因此，化学遗传学的屏幕必须有一个经过精心设计和严格遵守彻底和明确的分级制度。这种系统应当容易且完全地传达化合物的重要动力，并提供一个简明的方式来呈现最终画面的结果。构建这样一个系统的一种方法是利用一类系统中，这可以解释总体形态学的严重程度和命中的信任等级的胚胎。此外，类类别可以加上一个（+）或（ - ），或描述在感兴趣的区域（多个）的膨胀或还原性的效果。这里，斑马鱼胚胎从50％外包经受单独的化合物，从生物活性文库（恩佐化学试剂），以24高倍视野，再使用三种核糖探针鸡尾酒检测肾单位的段（ 图4A）由WISH测定。作为一个例子分级系统，包含一组胚胎有一个显着放大近卷积和的好的前肾的泰德小管（PCT），斑马鱼胚胎肾，会导致用于治疗以及被分类为（I类），而在这种情况下，将代表具有最严重的缺陷关联的类和最高水平的化合物信心观察（ 图4B）的表型。所述化合物将被标注了（PCT）和一个（+），完整的符号是（I类-厘+）（ 图4B）。分类的概念提供了一种简单而快速的方式来描述的信息有关的小分子的兴趣宝库，包括对生物体的化合物效应的严重程度，这是受药物，并且其中所述区域是所述方式的区域受影响（ 图4B）。 <img alt="图1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig1highres.jpg" width="500" /> 图1。＆＃160;手动斑马鱼胚胎的化学屏幕战略的一个研究人员可以测试可行的斑马鱼胚胎的96孔板的化学品，并在一个星期进行后续WISH处理。表演2周化学测试（第1周（1-6日）和第2周（7-12天））的可搭配第三个星期致力于取样分析。大约有96孔板值得一屏的样品可以拿下，并拍摄第3周（13-17日）。这种情况下相当于约200化合物在3周时间内筛选，相当于大约600化合物由9周完全屏蔽一个小型图书馆。本说明书的策略可以根据可用的资源进行修改。例如，三名研究人员可以减少时间完成约600化合物的屏幕〜3周相比，9周它会采取一个研究员。筛选策略可以通过指定的研究人员在屏幕上的特定方面，如药物治疗适应精神疾病和原位杂交或引导研究者独立地对化学品库的独立的部分执行整个筛选过程。 <img alt="图2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig2highres.jpg" width="500" /> 图2.流程：第6天屏的工作流程分解的化学筛选过程可以离散细分为6天。第1天由建立斑马鱼交配对（= /&gt; 25）提供胚胎各96孔板进行筛选的。 2天包括从配合腔室收集的胚胎和排列在一个很深的96孔板中，随后药物治疗。第3天，胚胎的愿望，包括dechorionation，组织固定和胚胎脱水的准备。最后的愿望是通过4-6天的胚胎进行。请注意，在固定的标本，替代染色程序可以很容易地substituted的心愿。 <img alt="图3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" width="500" /> 图3.板转印标签示意图。斑马鱼胚胎被排列在96孔板中药物处理，然后转移到24孔板为碎屑清除和链霉蛋白酶曝光。胚胎，然后转移到48孔板胚胎的准备，愿意，并组织固定。接下来，胚转移到12孔板上进行打分，成像和存储。胚胎精确的排列是通过使用颜色编码系统，使研究人员跟踪原产地为每个测试样品的化学品来实现的。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a> <img alt="图4" fo:content宽度=“5英寸”SRC =“/文件/ ftp_upload / 52063 / 52063fig4highres.jpg”WIDTH =“500”/&gt; 图4.实施例的分级制度：肾分割测定甲WISH实验使研究者进行染色的基础上被选择的探针的标识特定的细胞类型，允许改变胚胎的表型进行评价，根据变化的mRNA的转录位置和/或级别。作为一个例子，在斑马鱼胚胎肾三段，所述前肾，用画面混合1.屏幕混合物1是探针选自wt1b，其特异性地定位于足细胞（P）的一个鸡尾酒标记，slc20a1a这标志着卷积的基小管（PCT）和SLC12A1哪些标签远端早期（DE）段47。 A（+）符号旁边的区域标签用于标注的扩展或该区域的积极转变，而（ - ）符号用来决定一个地区的diminishment。在这里，EMbryos药13顺RA治疗有放大近曲小管和远端段早期对足细胞没有明显的效果完全丧失。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" target="_blank">请点击这里查看该图的放大版本。</a>

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A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

斑马鱼是一种极好的生物实验，研究脊椎动物发育过程和模型人类疾病。在这里，我们描述了如何用一个执行手动高通量化学屏幕在斑马鱼胚胎的协议整个安装原位杂交（WISH）读出。

手册小分子屏幕接近高通量使用斑马鱼胚胎

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