Name: a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos
Uploaded: 2014-11-08T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

Эта работа была поддержана финансирование для научно-исследовательской лаборатории Wingert из следующих: Национальные институты здравоохранения предоставляет K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О&#39;Коннор Starter Scholar гранта # 5-FY12-75; запуск средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук; и щедрый подарок в Университет Нотр-Дам от Элизабет и Майкл Галлахер от имени Галлахер семьи, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не участвовал в разработке исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарим Пола Т. Крегер-младший за предоставление критическую обратную связь на рукописи. Мы благодарим сотрудников Отделения биологических наук за поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся самоотверженность в помощи и благосостояния нашей данио колонии. Наконец, мы благодарим членов нашей researч лаборатория для их комментарии, обсуждения и идеи по этой работе.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:252px;">JoVE 51922 MATERIALS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:252px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 - 10 &#965;L natural pipet tips</td>
			<td style="width:191px;">USA Scientific</td>
			<td>1111-3800</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 50X E3 and DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB11072</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-3225</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">20X SSC</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB13156</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td style="width:191px;">BD-Falcon</td>
			<td>35-3226</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs - boil then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plate</td>
			<td style="width:191px;">CytoOne</td>
			<td>CC7672-7548</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">50 X E3</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 deep well plate</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>100-11-940</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate sealing mat</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10011-946</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B8503</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mg/mL using 100% DMF - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">block solution</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00448</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 &#176;C. (Keep unused BSA flakes at 4 &#176;C.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:349px;">Consult the manufacturer procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00450</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">4716728001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td style="width:101px;">35-1005</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">epT.I.P.S 20-300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>22492284</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">E7023</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">16140089</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430516</td>
			<td style="width:349px;">0.45 &#965;m CA / 1L volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">fine forceps</td>
			<td style="width:191px;">Roboz</td>
			<td style="width:101px;">RS-1050</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:252px;">Formamide</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB00600</td>
			<td style="width:349px;">Keep at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass basin 90 x 50</td>
			<td>Kimax Kimble</td>
			<td>23000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass pipette</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glass vial</td>
			<td style="width:191px;">Wheaton</td>
			<td style="width:101px;">225012</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycerol</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G7893</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">G8898</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">glycogen</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">HYB+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 &#965;L/&#965;L heparin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">INT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">I8377</td>
			<td style="width:349px;">Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:252px;">MAB</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:349px;">Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MABT</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 0.1% Tween-20 in MAB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">MeOH</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">34860-4L</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:191px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:101px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:191px;">Mediatech</td>
			<td style="width:101px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 0.5 - 10 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.019</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">multi 8-channel pipette 30 - 300 &#965;L</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>3122000.051</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">nanodrop</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">NBT stock</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">N6876</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:101px;">19210</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR-Film adhesive</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td>30127.48</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plate container (Pencil Box)</td>
			<td style="width:191px;">Sterilite</td>
			<td>1722</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:252px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pronase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11459643001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:349px;">Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3335399001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">rubber bulb</td>
			<td style="width:191px;">Fisherbrand Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-22</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11487671001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 45 &#965;L of NBT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:191px;">N/A</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td style="width:349px;">Generate using 31.5 &#965;L of INT and 35 &#965;L of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon</td>
			<td style="width:101px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11031171001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10881775001</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:191px;">Samco</td>
			<td style="width:101px;">202, 204</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:191px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:101px;">AB02038</td>
			<td style="width:349px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:252px;">waterbath</td>
			<td style="width:191px;">Thermo</td>
			<td style="width:101px;">51221073</td>
			<td style="width:349px;">(Model # 2831)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos

Данио рерио стали широко использоваться модель организм исследовать механизмы, лежащие в основе биологии развития и изучать патологию человека болезни из-за их значительной степени сохранения генетических ресурсов с человека. Химические генетика предполагает тестирование эффект, что небольшие молекулы оказывают на биологический процесс и становится все более популярным поступательное метод исследования для выявления терапевтических соединений. Данио рерио специально привлекательным для использования в химических генетики из-за их способности производить большие лапы прозрачных эмбрионах, которые внешне оплодотворенных. Кроме того, эмбрионы данио может быть легко препарат обрабатывают путем простого добавления соединения к эмбриону массовой информации. Использование цельного монтировать в гибридизация (жаль), экспрессия мРНК может быть четко визуализируется в эмбрионов рыбок данио. Вместе с использованием химических генетики и желаем, данио становится мощным весь контекст организм, в котором для определения клеточного и физиологическиеЭффекты малых молекул. Инновационные успехи были достигнуты в области технологий, которые используют процедуры проверки машины на базе, однако для многих лабораториях такие варианты не доступны или остаются непомерно. Протокол, описанный здесь описано, как выполнить вручную с высокой пропускной химическую генетический экран, который требует базовых ресурсов и может быть выполнена с помощью одного индивидуального или небольшой группы в качестве эффективного периода времени. Таким образом, этот протокол обеспечивает посильную стратегии, которые могут быть реализованы с помощью научно-исследовательских групп для выполнения химических генетику у рыбок данио, которые могут быть полезны для получения фундаментальных понимание процессов развития, механизмов болезни, а также для выявления новых соединений и сигнальные пути, которые имеют медицинской соответствующие приложения ,

Руководство подход, описанный здесь позволяет для одного исследователя эффективно и успешно провести высокой пропускной низкомолекулярные химические генетика экране с помощью данио модель эмбриона (рисунок 1). Используя этот метод, это практично для одного человека, чтобы выполнить экран химические генетики, например, что в течение 9 недель один человек (совершено в 40 ч рабочей недели) может провести опрос ~ 600 соединений (Рисунок 1) , Таким образом, время скамейке одного человека может обойти необходимость высокого ресурса с требованием оборудования, как автоматизированные системы. Компромисс в том, что руководство экран требуется несколько недель целенаправленные усилия. В противоположность этому, использование автоматизированных систем может сжимать время, затрачиваемое на 1-2 недели роботизированной времени, и может повлечь за собой относительно минимальных усилий исследователь в целом. Один из способов повышения эффективности и / или объем ручного экрана заручиться 2-3 исследователей в общей сложности, что позволит скрининг мрудные соединения, различной концентрации соединение, и / или скрининга в течение более короткого периода времени. Основные этапы в протоколе, чтобы завершить экран химические генетики в эмбрионов данио с пожеланием отсчета показаны как блок-схемы (рис 2). Экспериментальные задачи можно разделить на два типа рабочей недели: (1) воздействие химических веществ и зародыш маркировки, и (2) анализа и обработки изображений. В химической работы экспозиции неделю, эти шаги включают создание данио взрослых (день 1), сбор эмбрионов, выстроив эмбрионов и медикаментозное лечение (День 2), готовится эмбрионов для гибридизация (День 3), и в гибридизация (День 4 -6). В анализ / изображений неделю, исследователь анализирует экспрессию мРНК забить эмбрионов и изображения хиты (день 7-11). Важной частью выполнения экран химические генетики является последовательно и точно маркировать также места. Как экрана химические генетика рrocess подробно здесь включает передачу комплекта эмбрионов из колодца в одной тарелке, чтобы наилучшим образом в другом пластины несколько раз, потребность в точной и четкой маркировки имеет первостепенное значение, так что, когда химический попадание оценивается она может быть линейно и легко проследить к своей идентичности в химической библиотеки (рисунок 3). Самый простой способ гарантировать, что это маркировать пластины таким образом, что в любой момент времени расположение также для набора эмбрионов, обработанных соединением непосредственно соответствует химической библиотеки препарат пластины расположение также соединения, используемого для лечения этих эмбрионов (рис 3). Здесь двойная система колоризации и числовыми метками используется для организации образцы, которые были добавлены в экранных плит с использованием постоянных маркеров (Рисунок 3). Анализируя результаты экране высокой пропускной существует острая необходимость в разработке метода правильно организовать, комментировать и анализировать потенциальное малую молекулухиты. Таким образом, экран химические генетика должна иметь полное и четкое систему классификации, которая тщательно разработанный и строго соблюдаться. Такая система должна легко и полностью передать важные динамику соединения и обеспечить краткий способ представить результаты готового экрана. Один из способов, чтобы построить такую ​​систему, чтобы эмбрионов класса, использующих систему классов, которые бы объяснить общую морфологическую выраженность и доверие хит. Кроме того, эти категории класса может быть в сочетании с (+) или (-) для описания либо экспансивной или восстановительное воздействие на области (ов), представляющие интерес. Здесь, эмбрионы рыбок данио были подвергнуты индивидуальных соединений из биологически активного библиотеки (Enzo химических веществ) с 50% Эпиболия до 24 часов после оплодотворения, а затем анализировали по желанию, используя коктейль из трех рибонуклеотидными зондами для обнаружения сегменты нефрона (рис 4а). В качестве примера системы оценок, колодец, который содержит группу эмбрионов, у которых был резко увеличенный ближний convoluTed трубочка (РСТ) из предпочки, данио эмбриональной почки, приведет к тому, соединение, используемое для лечения, что хорошо быть классифицированы как (класс I), которое в этом случае будет представлять класс, связанный с самой сильной дефекта и самый высокий уровень уверенность в фенотипа наблюдается (4В). Соединение будет затем с аннотацией (РСТ) и (+), полный обозначения бытия (Класс I - РСТ +) (рис 4В). Эта концепция классификации обеспечивает простой и быстрый способ описать клад информации, касающейся небольшой интерес молекулу, в том числе от тяжести эффекта соединений на организм, регион, который зависит от препарата и способа, которым этот регион пострадавших (Фиг.4В). <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig1highres.jpg" width="500" /> На рисунке 1. &amp; #160;. Руководство данио стратегия эмбрион химический экран исследователь может реально проверить 96-луночный планшет химических веществ на эмбрионов данио рерио и выполнить последующую обработку WISH течение одной недели. Выполнение две недели химических испытаний (неделя 1 (День 1-6) и неделя 2 (День 7-12)) может работать в паре с третьей недели, посвященной образец анализа. Примерно две 96-луночные планшеты стоимостью образцов экранных может быть засчитан и отображаемого Неделя 3 (День 13-17). Этот сценарий составляет скрининга около 200 соединений в течение периода времени 3 недели, приравнивая к небольшой библиотеке около 600 соединений полностью экранированных 9 недель. Это руководство стратегия может быть изменена в зависимости от имеющихся ресурсов. Например, три исследователи могут сократить время, чтобы завершить экран примерно 600 соединений до 3 недель по сравнению с 9 недель было бы взять с одного исследователя. Стратегии скрининга могут быть адаптированы путем присвоения исследователей к конкретным аспектам экране, например, наркотиков удовольствияния и гибридизация или направляя исследователям самостоятельно выполнять весь процесс отбора на отдельных частях химической библиотеки. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig2highres.jpg" width="500" /> Рисунок 2. Блок-схема:. Разбивка 6 день экрана рабочего процесса Процесс химического скрининга можно дискретно разбиты на 6 дней. День 1 состоит из создания данио спаривания пары (= /&gt; 25) на поставку эмбрионов для каждого 96-луночный планшет будет показан. День 2 включает в себя сбор эмбрионов от сопрягаемых камер и упорядоченный массив их в глубоком 96-луночный планшет, после чего лекарственной терапии. На 3-й день, эмбрионы готовы для пожелаете, в том числе dechorionation, ткани фиксации и эмбрионов обезвоживания. Наконец, ЖЕЛАНИЕ выполняется на эмбрионах через день 4-6. Обратите внимание, что альтернативные процедуры окрашивания на фиксированных экземпляров может быть легко сubstituted для пожеланий. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" width="500" /> Рисунок 3. Пластина передачи маркировка схематично. Эмбрионы рыбок данио облеченные и наркотиков лечение в 96-луночного планшета затем переехал в 24-луночного планшета для вывоза мусора и проназой воздействия. Эмбрионы затем переехал в 48-луночных планшетах для подготовки эмбрионов, желание, и ткани фиксации. Далее, эмбрионы переносятся в 12-луночные планшеты для скоринга, визуализации и хранения. Точная выстроив эмбрионов осуществляется с помощью системы цветокодирующей, что позволяет исследователю отслеживать химической происхождения для каждого испытуемого образца. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" fo:content-ширина = &quot;5 дюймов&quot; SRC = &quot;/ файлы / ftp_upload / 52063 / 52063fig4highres.jpg&quot; ширина = &quot;500&quot; /&gt; Рисунок 4. Пример система оценок:. Почки сегментация анализ ЖЕЛАНИЕ эксперимент позволяет исследователю испачкать конкретные типы клеток, основанные на идентичности зондов, которые выбраны, позволяя оценить изменения в зародыше фенотипов в соответствии с изменениями в месте транскрипции мРНК и / или уровней. В качестве примера, три сегмента данио почки эмбриона, Предпочка, были помечены с помощью Mix Экран 1. Экран Mix 1 является коктейль из зондов, состоящих из wt1b, которые специально локализуется в подоцитов (P), slc20a1a который знаменует собой проксимальных извитых трубочка (РСТ), и slc12a1 который маркирует дистального рано (DE) сегмент 47. (+) Рядом с этикеткой области используется для аннотирования расширение или положительный сдвиг этой области, в то время как (-) символ используется диктовать уменьшению у региона. Здесь им,bryos препарат обрабатывали 13-цис-RA имеют увеличенный проксимальных извитых канальцев и полную потерю дистальной начале сегмента, без видимого эффекта на подоцитов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos at JoVE.com

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Данио является отличным экспериментальным организм для изучения позвоночных процессы развития и модели болезни человека. Здесь мы опишем протокол о том, как выполнить ручной химический экран высокой пропускной у эмбрионов рыбок данио с целый монтажа в гибридизация (жаль) читать при отъезде.

Руководство маленькая молекула экрана Подойдя высокой пропускной Использование эмбрионов данио

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Крупномасштабные данио рерио основе В естественных условиях Малый экран Молекула

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Экран с высоким Пропускная Biomining Целлюлаза активность метагеномных из библиотеки

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторы калиевых каналов входящего Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

Метод проницаемости от<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Эмбрионы для анализов малых молекул деятельности

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Восстановление взрослых данио сердца для высокой пропускной приложений

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...