Name: viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems
Uploaded: 2014-11-04T14:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Подготовка клеток и реактивов <ol><li> День до теста, пластины соответствующих клеток-хозяев для вируса в вопросе (таблица 1 и 2) в 90 - 100% слияния. </li><li> Подготовка фиксирующий раствор 10% формальдегида в дН 2 O. В примере, смешать 5,56 мл 36% акций формальдегида с 14,44 мл дистиллированной H 2 O (DH 2 O). ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте практика обращения соответствующих безопасных и вентиляция при помощи формальдегида. </li><li> Подготовка кристаллическим фиолетовым пятном: 1% кристаллическим фиолетовым (CV) в 20% -ном этаноле и Д. 2 O. </li><li> Подготовьте 2x бляшки носителя (тип клеток зависимую при концентрации 2 х; смотри Таблицу 2). Фильтр с использованием 0,2 мкм фильтр, если какие-либо реагенты не стерильны. </li><li> Подготовка иммобилизовать накладками (Таблица 3) <ol><li> Для жидких накладками, сделать стерильный 2,4% раствор Avicel в дН 2 O. Для предотвращения образования комков, добавить порошок в колбу, содержащую воду йна быстро смешивания с мешалкой, заливают в Avicel медленно и быстро перемешивают при комнатной температуре (RT). Когда раствор окажется слишком вязким для мешальник до гомогенизации, переключиться на колбу шейкера для&gt; 30 мин с тяжелой агитации для обеспечения равномерного гомогенизации. ПРИМЕЧАНИЕ: растворы могут быть сделаны при более низких концентрациях, но решения могут отделить и нужно будет ремикс для обеспечения гомогенизации. Рабочие растворы Avicel могут быть использованы в пределах от 0,6-3%. </li><li> После гомогенизации, автоклав решение и магазин запечатанный в РТ. </li><li> Для агарозы и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) накладок, подготовить маточного раствора в дН 2 O 2% КМЦ или 0,6% агарозы. Смешать с мешалкой и автоклав или микроволновой печи, чтобы привести в раствор. </li></ol></li></ol> 2. Растворы и инфекции <ol><li> На следующий день после посева, визуально проверить слияния и жизнеспособность клеток до начала анализа. Убедитесь, стандартный клеточной морфологии Aй ~ 90% сливной монослоя присутствует. </li><li> Выполните десятикратное серийное разведение инфекционных образцов. С помощью сотового питательной среды для размножения вирусов в качестве разбавителя (таблица 2). Вары число разведений необходимых на основе ожидаемой титра вируса в вопросе, и всегда использовать неинфицированных контрольного образца самостоятельно обеспечить сотовой жизнеспособность и помощь в идентификации бляшек. </li><li> Из серийных разведений, инфицировать клетки в течение 45 мин до 1 ч (таблица 1). Используйте достаточный объем посевного материала для покрытия ячейки, при сохранении объема как можно ниже, чтобы максимально увеличить контакт с вирусной монослоя (таблица 4). Аккуратно каменные плиты каждые 20 мин, чтобы обеспечить даже освещение и предотвратить сотовой монослоя от высыхания. </li><li> После инфекции, накладывать соответствующий объем иммобилизации среды непосредственно к посевного в скважине (таблица 2) с использованием 1: 1 смесь 2x зубного налета средств массовой информации и immobilizчисле наложение выбора (CMC, агарозы или Авицел). Осторожно перемешать. <ol><li> Для жидких накладками, смешать 1: 1 с утепленным 2x налета СМИ и 1.2 - 2.4% RT фондовом Avicel получить рабочий раствор 0,6-1,2% Avicel наложения среды. </li><li> Для агарозном наложения, использовать 1: 1 смесь утепленных 2x налета СМИ и исходного раствора с подогревом 0,6% агарозы, место в 56 ° С водяной бане в течение 30 мин, чтобы уравновесить температуру получения конечной концентрации агарозы / наложения 0.3 %. </li><li> Для КМЦ, подготовить 2% исходного раствора и лечения, как описано в агарозном наложения. </li><li> При применении накладку на монослое, всегда в равновесие горячей агарозы или CMC в 56 ° C водой, чтобы предотвратить повреждение монослое. Убедитесь решение теплая, но не горячая на ощупь, чтобы предотвратить гибель клеток и снижение вирусные титры. Большинство агарозные накладки начнет затвердевать ниже 42 ° С, работать быстро и / или подготовить небольшие партии для предотвращения затвердевания при работе. </li></ol></li><li> После добавления оверлея, инкубировать пластин для производства различных бляшки, которые явно счетно. Налет формирование может занять 2-14 дней в зависимости от вируса анализируются, таблицу 1. Примечание: После того, как жидкие накладными пластины помещают в инкубатор, не перемещать их. Движение жидкости накладок в течение инкубационного периода приведет к размытыми бляшек. Агарозные и CMC пометки полутвердые и могут быть перемещены или периодически проверять под световым микроскопом, чтобы контролировать развитие бляшек. </li></ol> 3. Крепление и окрашивания клеток <ol><li> Для фиксации клеток, слить или аспирации наложение Avicel, и исправить клетки с помощью 10% -ного раствора формальдегида в течение 30 мин, чтобы в течение ночи (&lt;1 мл на лунку для луночного планшета в 6). <ol><li> Для агарозы или CMC, непосредственно добавить раствор формальдегида в накладкой в ​​течение 1 часа в ночь. Примечание: Образцы могут храниться в течение длительного периода времени в фиксаторе условии, что он делаетне испаряются и высыхают, как это может исказить монослой. </li></ol></li><li> До окрашивания и после фиксации, отбросить формальдегид и удалить полутвердые заглушки для агарозы и КМЦ с проточной водой или вручную, или с помощью шпателя. Промыть Avicel бляшки с водой, чтобы удалить остатки наложения / фиксатор перед окрашиванием. </li><li> Для окрашивания, покрывают клетки с минимальным количеством кристаллического фиолетового раствора в течение ~ 15 мин. Рок плиты при необходимости обеспечить равномерное покрытие. </li><li> Аккуратно смойте кристаллическим фиолетовым пятном водой. После того, как фиксированной, окрашенных, и сушат, магазин бляшки на неопределенный срок для последующего анализа. </li></ol> 4. Определение титров вируса <ol><li> Граф бляшки в каждую лунку, взяв среднее за любые технические повторов одного и того же разведения. Для больших форматов пластин, скидка скважин с менее чем 5 или больше 100 бляшек. Принять к сведению размер бляшек и морфологии. Отрицательный контроль должен иметь равномерный монослой иможет быть использован в качестве контроля опорной. </li><li> Определить титр вируса на фондовом образца, принимая среднее число бляшек для разбавления и обратного общего коэффициента разбавления. </li></ol><img alt="Уравнение 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> Примечание: В качестве примера, 30 и 32 бляшек для повторах в 1 х 10 -7 разведений [31 (в среднем) 10 / -7 (разведение) х 0,4 мл (инокулята)] даст титр 7,75 х 10 8 БОЕ / мл.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Наиболее важным фактором для успешного бляшек заключается в оптимизации протокола для конкретного вируса в культуре в вопросе, как условия могут существенно различаться. Ключевые моменты, которые следует учитывать, являются: провести сотовой совместимость с вирусом в вопросе, соответствующих вирусных условий роста, достаточных диапазонах разбавления для того, чтобы четко различать бляшки, и правильный подбор наложения и окрашивание клеток и вируса в вопросе. В то время как VEEV и RVFV и расти в очень похожих условиях с использованием многих из тех же типов клеток хозяина, различия в налета морфологии и кинетики роста существенно различаться. При использовании клетки Веро на налета анализов, которые традиционно используются в качестве распространения и индикатора клеточной линии для геморрагических вирусов лихорадки и альфавирусов, VEEV обычно вырастает до высоких титров чем RVFV и демонстрирует увеличилось кинетики репликации, разработке больших единых бляшек на 48 HPI 4, 10 - 12. В отличие от VEEV, RVFV требуется 72 HPI и демонстрирует бляшки, которые, как правило, гораздо меньше, и переменный размер. В противоположность RVFV и VEEV, вирус гриппа является весьма специфические клетки-хозяина, и может быть трудно распространяться через культуре ткани. Для вируса гриппа, вирусного входа и слияния, как правило, по инициативе связывание рецептора на поверхности клетки с вирусной гликопротеина hamagglutinin (HA), которая является посредником вступление в клетки-мишени путем связывания с α-сиаловой поверхности кислоты рецептора клетки-хозяина. НА представляет собой тример гликопротеин, присутствующий в мембранной оболочке всех вирусов гриппа и требует расщепление в субъединиц HA1 и HA2 по конкретной клетки-хозяина протеазы. Чтобы еще более усложнить вопрос, эти сайты расщепления может часто отличаются вирусных штаммов 13. Как экспрессии протеазы, способные к расщеплению HA ограничивается конкретными тканей, протеазы ARе часто добавляют к среде для культивирования клеток для того, чтобы облегчить синтез вирусной и вступление в выбранной клетке-хозяине, 13. ТРСК-трипсином является одним из примеров широко используемом протеазы, который используется в клеточной культуре с обеих MDCK и клетки Vero: содействие репликацию мульти-цикла (в отсутствие какого-либо инактивации трипсина сыворотки) через активацию протеолитической вирусной HA 14,15. Как показано в этом исследовании и других, различия в вирусных жизненных циклов могут влиять наложения выборы, форматы плит и раз коллекцию, со значительными отклонениями среди различных классов и видов вирусов. В нашем исследовании, агарозы накладки продемонстрировал более четкие бляшки на более высоких титров, чем любой CMC или жидких накладок для обоих RVFV и вируса гриппа В, усиливая его полезность среди широкого спектра вирусов и типах клеток. Используя низкую конечную концентрацию агарозы большую помощь в удалении твердых пробки и упрощенную окрашивание. CMC в целом продемонстрировал рoorest эффективность в виде наложения на всех трех вирусов проверенных и производимых очень маленькими и нечеткими бляшек на вирус гриппа B. Хотя в целом CMC продемонстрировали наименее желательными характеристиками, его применение в стремительно растет и чрезвычайно вирулентные вирусы могут оказаться выгодным, как это было, кажется, уменьшить размер бляшек только с минимальным снижением титра. Жидкость накладка оказалась наиболее универсальным в том, что он был чрезвычайно прост в приготовлении, увеличилось простоту использования, и был сопоставим с агарозы через все вирусы выбранных. В формате более высокую пропускную способность 96-луночного планшета, применения и удаления не ингибируется в результате затвердевания как с традиционными накладками, и при условии, точные и стабильные результаты. Фактором при использовании жидких накладки заключается в непрозрачной окраски и неспособности контролировать образование бляшек в тарелки не могут быть перемещены до точки сбора, ограничения этого адаптацию к вирусам с ранее характеризующихся кинетики репликации. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; Незначительные изменения в условиях бляшек может существенно изменить результаты, а оценка и эффективность любой новой системы или техники всегда оправдано. В то время как оптимизировать и стандартизированный протокол бляшек не существует для каждой ситуации, наш доклад продемонстрировать универсальность и простоту использования в традиционных, так и новых жидких накладками для налета анализов, обеспечивая при этом достаточную основу для дальнейших модификаций пользователей.

Точная изоляция и количественное определение жизнеспособных вирусных образцов неизменно продолжающееся исследование цель в вирусологии. Он не был до появления бляшек в 1952, что является средством количественно и качественно рассчитать животных вирусные титры впервые была разработана 1,2. Эта техника была впервые адаптирована и изменена с фага анализов, которые ранее были использованы для расчета титры фондовых бактериофагов в биологии растений 1,2. В то время как альтернативные средства для количественного определения вирусной тех пор были разработаны и адаптированы, таких как иммунологические анализы, флуоресценции и просвечивающей электронной микроскопии, перестраиваемого зондирования резистивный импульса (TRPS), проточной цитометрии, рекомбинантные репортерных систем, и количественный ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР Qrt) эти методы не в состоянии идентифицировать и количественно репликации компетентных вирионов 1,3. В то время как прогресс в технологиях и методах продолжать совершенствовать и изменять ландшафт; plaquе анализы по-прежнему представляют золотой стандарт в определении вирусных концентрации инфекционных литических вирионов 1,4. Во время анализа бляшек, сливающийся монослой клеток-хозяев, заражен литической вируса неизвестной концентрации, которая была серийно разведенной в счетной диапазоне, как правило, от 5-100 вирионов. Инфицированные монослои затем покрыта накладываемого иммобилизации среды, чтобы предотвратить вирусную инфекцию от распространения через разбора либо механического или конвекционного потока жидкой среды в процессе размножения вирусов. В то время как твердые или полутвердые накладки, такие как агароза, метилцеллюлозы или карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) традиционно использовались, жидкие накладки становятся все более привлекательной альтернативой с развитием новых жидких накладками, такие как Avicel 5- 7. Зубной налет анализы, использующие жидкий по сравнению с традиционными накладками имеют ряд преимуществ, как наложение может быть заявлварьировали при комнатной температуре, и приложения и снятия значительно легче. Как жидкие накладки не требуют потепления, нежные и термолабильный вирусы могут также оказаться проще бляшки. После первичного инфицирования и применения иммобилизирующим наложения, отдельных бляшек или зон гибели клеток, начнет развиваться как вирусная инфекция и репликации ограничены в окружающую монослоя. Зараженные клетки будут продолжать цикл репликации лизис-инфекции, в дальнейшем распространяясь инфекцию, в результате чего все больше и больше различных и дискретных бляшек. В зависимости от вирусной кинетики роста и используемой клетки-хозяина, видимый налет, как правило, образуют в течение 2-14 дней. Сотовые монослои могут быть затем подсчитывали с помощью стандартной светлой поле микроскопа, или более, как правило, фиксированной и контрастному по нейтрального красного или кристалла насильственных для того, чтобы легко идентифицировать бляшки невооруженным глазом. Есть большое разнообразие доска встречных пятен доступны, каждый предлагая йОДП конкретные преимущества и недостатки. Кристалл фиолетового обычно добавляют в точке сбора и после фиксации / снятия накладки, обеспечивая быстрый и отчетливый счетчик пятно, который позволяет для идентификации очень маленьких бляшек при смешанной морфологией присутствует. Обычный красный имеет преимущество раннего применения и постоянном контакте с накладкой, что позволяет для мониторинга в реальном времени разработки образование бляшек, что особенно полезно при работе с неизвестным вирусом или репликации кинетики. Мы, однако, обнаружили, что окрашивание, как правило, не в отличие при использовании нейтрального красного. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) тетразолия бромид -2,5-дифенил (МТТ) дает несколько преимуществ, как желтые пятна цветные красители живые клетки темно-синий и вирусные бляшки можно пересчитать без удаления верхнего слоя, как с нейтральным красным. Высокая контрастность между живыми и мертвыми клетками предоставляемых МТТ также позволяет обнаружить небольшие бляшки в более раннем времени точка после заражения, Хотя хранение будет по-прежнему требовать удаления верхнего слоя 8. Как кристаллический фиолетовый можно просто выполнен в растворе воды и спирта, и обеспечивает высокую степень чувствительности к смешанной морфологией бляшек, мы выбрали его в качестве предпочтительного, и упрощенной счетчика пятно на протокол продемонстрировал, как мы используем несколько семейств хорошо охарактеризованные вирусы. После фиксации и окрашивания зараженный клеточный монослой, бляшки подсчитываются, чтобы титровать образцы вирусов запаса по бляшкообразующих единиц (БОЕ) на миллилитр. Падение журнала Следует отметить, между серийных разведений и, в зависимости от размера пластины, между 5-100 бляшек, с отрицательным контролем, используемого в качестве ссылки. Статистически образцы будут меняться на 10% на каждые 100 бляшек при сравнении образца повторяет 3. Преимущество использования зубной налет анализов для определения вирусные титры заключается в их способности для количественного определения фактического количества инфекционных вирусных частиц Within образца. Как несколько вирионы могут потенциально заразить одну ячейку, терминология единиц по сравнению с вирионов используется во время налета титрования 1,2. Налет морфология может варьироваться резко при различных условиях роста, а также между вирусных видов. Налет размер, четкость, определение границы, и распространение все должны быть отмечены как они могут предоставить ценную информацию о росте и факторов вирулентности вируса в вопросе. Основные принципы анализа бляшек также могут быть адаптированы и модифицированы различными способами, например, в использовании фокус формирования анализов (FFAs). FFAs не полагаться на лизиса клеток и counterstaining обнаружить образование бляшек, а использовать иммуноокрашивания методы непосредственно обнаружить внутриклеточные белки вируса через меченых антител. Повышенная чувствительность, снижение времени инкубации после заражения, а главное способность количественного без литические вирусы все различныПреимущества при использовании FFAs. В то время как широко используется, критические факторы, ограничивающие в FFAs по сравнению с традиционным методом бляшек заключается в необходимости соответствующих антител и способностью только зонд для белковых субъединиц вируса по сравнению с фактическим инфекционных вирионов 4. Для целей данного исследования, мы ограничим наше обсуждение классических налета анализов и описывают применение традиционных твердых и полутвердых накладками (агарозы и СМС), наряду с новыми жидкость микрокристаллических накладками целлюлозы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Зубной налет анализы остаются одним из наиболее точных методов прямого количественного определения инфекционных вирионов и противовирусных веществ через подсчета дискретных бляшек (инфекционных единиц и клеточных мертвых зон) в клеточной культуре. Здесь показано, как выполнить основную бляшек, и как отличающиеся накладки и методы могут повлиять образование зубного налета и производства. Обычно твердые или полутвердые наложения субстраты, такие как агароза или карбоксиметилцеллюлоза, были использованы, чтобы ограничить распространение вируса, предотвращая неразборчивое инфекцию через жидкую среду роста. Иммобилизованные накладки ограничить сотовой инфекции в непосредственно окружающей монослоя, что позволяет формирование дискретного счетного очагов и последующего образования бляшек. Чтобы преодолеть трудности, связанные с использованием традиционных накладки, роман жидкость наложения использования микрокристаллической целлюлозы и натрий карбоксиметилцеллюлозу все чаще используется в качестве замены в стандартебляшек. Жидкие наложения налета анализы могут быть легко выполнены либо в стандартных 6 или 12 форматов а пластины в соответствии с традиционными методами и не требуют специального оборудования. Из-за его жидком состоянии и последующей легкости применения и удаления, форматы микрокультуры пластины, альтернативно, может быть использован в качестве быстрого, точного и высокой пропускной альтернативы большего масштаба вирусных титрования. Использование не нагретой вязкой жидкости полимера дает возможность упростить работу, экономит реагенты, инкубатор пространство, и повышает безопасность работы при использовании в традиционных или высоких сдерживания лабораториях как без отопления реагента или стеклянную посуду, необходимые. Жидкие накладки могут оказаться более чувствительными, чем традиционные накладками для некоторых термолабильный вирусов.

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Экономически эффективный метод для отслеживания источника микробного Использование Конкретные человека и животных вирусов

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Бляшек на мышиной норовирус

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Использование наложения Пробирной для Качественно Измерьте бактериальной продукции и чувствительность к пневмококковой Бактериоцины

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Фаговые Phenomics: Физиологические подходы к характеризации Роман вирусных белков

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Раннее проникновение вируса Анализы для идентификации и оценки антивирусных соединений

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...