Name: visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy
Uploaded: 2014-10-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy at JoVE.com

Это исследование было частично поддержана NIH наград 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.

Все животное работа была сделана в соответствии с правилами и руководящими принципами Института исследования животных на колледже Альберта Эйнштейна медицины. 1. Условия рост C. neoformans H99 (Серотип) <ol><li> Вырастить индивидуальный C. neoformans (Сп) колонии на агаре Сабу...

<ol>
	<li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System.">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+interactions+with+macrophages:+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen.">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans.">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li><li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+&#8212;+a+case+of+convergent+evolution.">Intracellular pathogenic bacteria and fungi &#8212; a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages.">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast.">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15 (2007).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2/3+complex-mediated+actin+polymerisation.">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li><li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis.">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li><li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans.">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li><li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li></ol>

Здесь мы описали метод, посредством которого грибковые-макрофагов взаимодействия могут быть записаны и проанализированы в реальном времени в течение 24 час. Наша лаборатория использует этот протокол для изучения многих временных аспектов не-литической экзоцитоза и будет продолжать и...

Этапы грибковой инфекции между криптококковых клеток и макрофагов, хорошо документированы 1-3. После дрожжевые клетки поглощаются макрофагами, различные взаимодействия может произойти: макрофагов может лизировать выпуская его грибковой нагрузки во внеклеточное пространство, или он может контролировать инфекцию, сохраняя дрожжевых клеток в пределах своей клеточной мембраны 4. Тем не менее, несколько лет назад новый результат был описан независимо друг от друга две группы: не-литическую экзоцитоза, процесс, в котором макрофагов исключены некоторые или все из криптококковых клеток в окружающую среду или соседней соте, и оба хоста и возбудитель остаются жизнеспособными 5 -8. Несколько исследований пытались понять молекулярные механизмы, лежащие в этом взаимодействии, но мы до сих пор не имеют полное представление о том, что движет этим явлением. Возможность захвата изображения в режиме реального времени, а затем впоследствии проанализировать несколько инфицироватьред макрофаги позволяет ответить на многие вопросы о физических свойствах окружающих не-литическую экзоцитоз в отношении сроков, пространственного потенциала, изменения в морфологии и даже стресс макрофагов во грибковой инфекции. По позволяя клеткам быть размещены в среде, которая сравнима с инкубатора, мы можем увидеть динамическую природу макрофагов-грибковые взаимодействий клеток. Исследователи использовали эту технику для изучения различных компонентов этого процесса. Роль фагосомы в этом процессе было сделано очевидным использованием флуоресцентного окрашивания и актин блокаторов 9, в то время как другая группа использовал этот метод, чтобы показать, что не-литический экзоцитоз был заблокирован в клетках, которые имели WASH нуклеирующий белковых доменов удален 10. Эффект цитокинов сигнализации также было установлено при помощи в режиме реального времени микроскопии 11. Этот процесс не ограничивается C. neoformans, как это наблюдалось также с Candida Albicans, соседнийг грибкового патогена, который имеет возможность инфицировать макрофаги 12. Эти данные приведены примеры, как этот метод может обеспечить большой объем информации в области, которую мы так мало знаем о.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:227px;">DF0109-17-1</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sabouraud Dextrose Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0382-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dubelcco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum ( FCS)&#160;</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCTC 109</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21340-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3003 Tissue Culture Petri Dishes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellStripper</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-g</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NC 9222016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAb 18B7</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Non-commerical antibody produced in our lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy

Многие аспекты инфекции макрофагов по Cryptococcus neoformans были широко изучены и определены. Тем не менее, один частности взаимодействие, что не ясно понимать, не является литическую экзоцитоз. В этом процессе, дрожжевые клетки высвобождаются во внеклеточное пространство с помощью механизма плохо понимаемой, что оставляет как макрофаг и Сп жизнеспособным. Здесь мы опишем, как следовать большое количество индивидуально инфицированных макрофагов для 24 часами инфекции периода по времени истек микроскопии. Зараженные макрофаги расположены в нагревательной камере с CO 2 атмосферы, прикрепленной к микроскопом, который обеспечивает те же условия, как и культивирования клеток инкубатора. Онлайн цифровая микроскопия может предоставить информацию о динамических взаимодействий между организмом хозяина и возбудителем, недоступной из статических изображений. Будучи в состоянии визуализировать каждый инфицированной клетки могут дать ключи, чтобы, как макрофаги справиться с грибковыми инфекциями, и наоборот. Эта техника яса мощным инструментом в изучении динамики, которые находятся за сложного явления.

Изображения что этот метод производит могут быть проанализированы в различных способов сбора информации, окружающий то, что происходит после того, как клетки фагоцитоза С. neoformans. Как видно на рисунке 1, существует примерно 100 макрофаги, которые либо зараженного или неинфи?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy at JoVE.com

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Визуализация Номера для литическую экзоцитоза<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; От макрофагов с помощью цифровых световой микроскопии

Мы опишем, как визуализировать macrophage- C. neoformans (Сп) взаимодействия в режиме реального времени, при этом особое внимание на процесс не-литической экзоцитоза с использованием цифровой световой микроскопии. Используя эту технику индивидуально зараженные макрофаги могут быть изучены, чтобы установить различные аспекты этого явления.

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Визуализация сотовый к клетке передачи ВИЧ-инфекции с помощью флуоресцентного клоны ВИЧ и жить конфокальной микроскопии

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Макрофагов Холестерин истощение и ее влияние на фагоцитоз<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Исследование тучных клеток секреторных гранул; от биосинтеза к экзоцитозу

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Баллистической трансформации флуоресцентного Tagged гена в оппортунистических грибковых возбудителя<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Измерение физиологических реакций<em&gt; Drosophila</em&gt; Сенсорными нейронами липид феромонов с использованием живых визуализации кальция

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Визуализация внутриклеточных SNARE людьми флуоресценции жизни изображений микроскопия

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...