Name: large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من القانون الألماني والدولة برلين. تم رصد معالجة الزرد من قبل السلطة المحلية لحماية الحيوان (LaGeSo، برلين-براندنبورغ). 1. الحصول على اسماك الزرد الأجنة لاستخراج القلب <ol style=";text-al...

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+technology+-+enhanced+versatility,+persistent+challenge.">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li><li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics.">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry).">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

هذا البروتوكول يسمح للتخصيب السريع للأنسجة القلب الزرد الجنينية للتعبير الجين يحلل. كمية ونوعية عينة الحمض النووي الريبي القلب محددة يعتمد إلى حد كبير على بضع خطوات حاسمة: أولا، كمية من العينة تحسنت كثيرا إذا تم منع فقدان القلوب في كل خطوة من البروتوكول، منذ تنقية RNA...

ويستخدم الزرد (دانيو rerio) على نطاق واسع في علم الأحياء التنموي لدراسة توالد الأعضاء في الجسم الحي بسبب تطورها الجنيني سريعة وشفافة وخارج الرحم، جنبا إلى جنب مع صغر حجمها وتوافر خطوط مراسل المعدلة وراثيا مع التعبير الأنسجة محددة من البروتينات الفلورية. بشكل خاص يناسب هذا الفقاريات الصغيرة بشكل جيد لدراسة تطوير القلب بسبب الأوكسجين للجنين الزرد في وقت مبكر لا تعتمد على ضربات القلب وتدفق الدم. وقد سمحت هذه الميزات توصيف أعداد كبيرة من المسوخ القلب والأوعية الدموية 1،2 والزرد هو الآن كائن نموذج المعترف بها على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب 3. لدراسة التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني، ويتم تحليل النصوص عادة من قبل جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) 4، وRT-QPCR 5، 6 ميكروأرس، أو الجيل القادم التسلسل (RNA تسلسل) 7. في حينWISH يسمح للتحليل المكاني الزماني للالتعبير الجيني داخل الجنين بأكمله، يتم تقييمها عادة مستويات النص التي كتبها RT-QPCR، ميكروأرس أو النهج RNA يليها. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب تخصيب الأنسجة لمحدد التنميط التعبير الجيني. منذ القلب الجنينية الزرد يمثل جزءا صغيرا من جنين كامل، ودراسات Transcriptome على أثناء التطور القلب تتطلب بروتوكول للتشريح وإثراء القلوب. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، من المهم للحفاظ على نسيج القلب تعمل بكامل طاقتها حتى استخراج الحمض النووي الريبي. هنا، نحن تصف بروتوكول للعزل بسرعة طبيعية من الناحية الفسيولوجية وضرب قلوب من مئات الأجنة الزرد الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية بكفاءة لمزيد من التحليلات. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول ذكرت من قبل بيرنز وماكراي 2006 8. لإثراء الأنسجة القلبية، سواء طرق استخدام خط مراسل عضلة القلب المعدلة وراثياوالاستفادة من الخصائص التفاضلية التصاق قلوب الجنينية الزرد مقابل الأنسجة الأخرى. لفترة وجيزة، قبل pipetting العديد من الأجنة صعودا وهبوطا من خلال طرف ماصة ضيق، يتم الإفراج قلوب في وقت واحد من الهيئات الجنينية وبعد ذلك فصل من الحطام الجنينية في خطوتين الترشيح السريعة؛ ثم يتم فرز قلوب fluorescently المسمى يدويا من الحطام المتبقي وجمع لمزيد من المعالجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

يتكون القلب الجنينية الزرد فقط بضعة مئات من الخلايا، التي تمثل سوى جزء صغير من الجنين بأكمله. لذلك، لمنع Transcriptome على القلب من أن تقنع من خلال Transcriptome على الجنينية العالمي، فمن الضروري لجمع أعداد كافية من قلوب لمزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، مع استمرار التطور القلب الزرد بسرعة، وجمع القلب وطرق استخراج الحمض النووي الريبي تحتاج إلى أن تكون سريعة لضمان تجانس العينات. هنا، نقدم اليدوي السريع بروتوكول تشريح لجمع وظيفية / قلوب الضرب من الأجنة الزرد. هذا هو شرط أساسي لاحق القلب محددة استخراج الحمض النووي الريبي لتحديد مستويات القلب محددة التعبير الجيني عن طريق تحليل Transcriptome على مثل الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-QPCR). وتستند هذه الطريقة على الخصائص التفاضلية لاصقة من القلب الجنينية الزرد مقارنة مع الأنسجة الأخرى. وهذا يسمح للفيز السريعالفصل sical من القلب من أنسجة extracardiac من قبل مجموعة من فلويديك تعطيل قوة القص، والترشيح تدريجي وجمع اليدوي المعدلة وراثيا قلوب fluorescently المسمى.

هنا، نحن تصف تمثيلية تجربة تشريح القلب باستخدام الزرد تيراغرام (myl7: GFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9، الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) حصرا داخل عضلة القلب (الشكل 1). جمعنا كل من قلوب تشريح والأجنة من التي كانت تستمد لتقييم نقاء العينة القلب. لفترة وجي?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة.

على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

SiRNA نانوحبيبات بوساطة إسكات الجينات في قلب الزرد الكبار

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...