Name: identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00
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AF è stato sostenuto da una borsa di studio a partire dal Consiglio europeo della ricerca nell&#39;ambito del Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7 / 2007-2013) / accordo di sovvenzione del CER n ° 203.413 e dal Centro Minerva per la Bio-ibrido systems.HA complesso e AI sono supportati dal Dalia e Dan Maydan Fellowship per gli studenti di laurea specialistica presso l&#39;Università Ebraica di Gerusalemme.

1. Progettazione di un array di peptidi <ol><li> Dividere la sequenza della proteina bersaglio in parte si sovrappongono 10-20 residui peptidi. Variare la quantità di sovrapposizione sulla esperimento specifico e le risorse del laboratorio esecuzione, ma in linea di principio più lunga è la sovrapposizione meglio. Nel progettare i peptidi tengono conto noto elementi della struttura secondaria della proteina che può essere responsabile per l&#39;interazione. </li><li> Ordinare l&#39;array peptide progettato presso ...

<ol>
	<li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptides+to+study+protein&#8211;protein+interactions.">Using peptides to study protein&#8211;protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li><li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries.">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry &amp; Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot-synthesis:+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable,+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support.">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li><li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays.">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li><li>Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Mapping+of+Linear+Antibody+Epitopes+in+Human+Serum+Albumin+Using+High-Density+Peptide+Arrays.">Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays.</a> PLoS ONE. 8 (7), (2013).</li><li>Uecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+peptide+for+the+FLT3+receptor+tyrosine+kinase.">A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase.</a> British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).</li><li>Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+studies+using+peptide+arrays:+the+example+of+HIV-1+Rev-integrase+interaction.">Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction.</a> Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique:+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports&#8212;principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports&#8212;principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays.">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li><li>Castiel, A., Danieli, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stil+protein+regulates+centrosome+integrity+and+mitosis+through+suppression+of+Chfr.">The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr.</a> Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).</li><li>Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STIL+protein+contains+intrinsically+disordered+regions+that+mediate+its+protein-protein+interactions.">The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions.</a> Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).</li><li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification.">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li><li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation.">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li><li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells.">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li><li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation.">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li><li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells.">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li><li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint.">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li><li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCL/TAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell.">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li><li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity.">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li><li>Olaussen, K. a., Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines.">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li><li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Vif&#8211;A3G+interaction+using+peptide+arrays:+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides.">Mapping the Vif&#8211;A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li><li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2.">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li><li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+(tBID)+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+(MTCH2)+Protein:+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY.">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li><li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly.">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li></ol>

Lo screening matrice Peptide è un ottimo strumento per identificare i siti di legame di una proteina bersaglio nei suoi partner. Questo test è veloce e facile da eseguire e il risultato può essere ottenuto in uno o due giorni lavorativi. Proiezione matrice Peptide è versatile e può essere utilizzato per vari scopi. Può essere usato per caratterizzare modifiche Traduzione successive come fosforilazione e identificare substrati di chinasi. Ad esempio: la chinasi FLT3, che è legato alla leucemia mieloide acuta, fosf...

Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula vivente. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine ​​sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine ​​integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni delle proteine. Questo perché i peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentono la messa a fuoco su un sito di interazione specifica su un lato e più bersagli proteici in maniera elevata produttività dall&#39;altro 1,2 mano. Proiezione matrice Peptide è un veloce, facile da eseguire metodo per ottenere una grande quantità di dati sulle interazioni di una proteina bersaglio con numerosi partner in breve tempo 3. A differenza di altri metodi biochimici o biofisici per la rilevazione e l&#39;analisi di interazioni proteina-proteina, lo screening matrice peptide richiede una concentrazione molto bassa di proteine ​​e può rilevare molto debole legame. Array di peptidi possono essere utilizzati per molte applicazioni nelle interazioni peptide-proteina come la mappatura della proteina-proteina o recettore-ligando siti di interazione 4, interfacce omo- o etero-oligomerizzazione, anticorpi che caratterizzano epitopi 5, studiando attività enzimatiche 6 e throughput elevato struttura- rapporto di attività (SAR) studia 7. Per un esame approfondito circa lo screening gamma peptide vedere Katz et al. 4 Attualmente esistono diversi tipi di matrici di peptidi. Ci sono due principali strategie sintetiche per la preparazione di matrici peptide: sintesi dei peptidi prima di essere esposti al supporto solido, o per la sintesi di peptidi direttamente sul supporto solido, principalmente con la tecnica SPOT 4,8. Lapeptidi sono sintetizzati sul supporto solido solito da 9-fluorenilmetilossicarbonil (Fmoc) chimica 8. Tra gli schemi sintetici comuni sono allegati peptide attraverso il terminale N (ad esempio, JPT array pepstar 9) e l&#39;attaccamento peptide attraverso il terminale C (ad esempio, PEPSCAN array pepchip 10, JPT array pepspot 9 e INTAVIS array celluspot 11) 4. Il supporto solido può variare e così fa la chimica dell&#39;accoppiamento peptide ad esso. Peptidi Cys-terminati possono essere allegati ai vetrini tramite il gruppo tiolo 12. Il terminale N di un peptide può essere legato covalentemente ad un gruppo ossidrile sulla membrana di cellulosa attraverso esterificazione degli aminoacidi allegato 8. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening array di peptidi come metodo per lo studio delle interazioni proteina-proteina. L&#39;array che abbiamo usato è l&#39;array Celluspots, che è un micro-array che contiene grandi amount di macchie (duplicati fino a 384 punti) su una piccola membrana di cellulosa supportati da un vetrino. In questo modo si lavora con bassi volumi di proteine ​​e anticorpi e di ottenere significative quantità di dati per ogni singolo esperimento. Questa matrice contiene anche ad alta densità peptide che permette la rilevazione di bassa affinità di legame. L&#39;array è stato utilizzato per mappare l&#39;interazione STIL-CHFR, che è molto importante per il controllo della proliferazione delle cellule normali 13. Interazione incontrollata tra le due proteine ​​può portare allo sviluppo del cancro. Con la mappatura questa interazione abbiamo trovato il sito di legame specifico e residui 14 vincolanti. Questo spiana la strada per la progettazione di inibitori razionali che inibiscono questa interazione proteina-proteina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:231px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptide array</td>
			<td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His-probe Antibody (H-3) HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8036 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-ECL Kit</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>20-500-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skim Milk</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LAS-3000 camera&#160;</td>
			<td>FUJI film</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays

Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula e soggiorno di controllo omeostasi dell&#39;organismo. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine ​​sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine ​​integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni proteina da peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentire la messa a fuoco su siti specifici di interazione. Array peptidici permettono l&#39;identificazione dei siti di interazione tra due proteine ​​così come screening per peptidi che si legano alla proteina bersaglio per scopi terapeutici. Essi consentono inoltre ad alto rendimento studi SAR. Per l&#39;identificazione di siti di legame, un Typimatrice peptide cal solito contiene parzialmente sovrapposte 10-20 residui peptidi derivati ​​dalle sequenze complete di una o più proteine ​​partner della proteina bersaglio desiderato. Screening matrice per legare la proteina bersaglio rivela i peptidi leganti, corrispondenti ai siti di legame delle proteine ​​partner, in un modo semplice e veloce utilizzando solo piccole quantità di proteine. In questo articolo si descrive un protocollo per lo screening array di peptidi per la mappatura dei siti di interazione tra una proteina bersaglio e dei suoi partner. L&#39;array peptide è stato progettato sulla base delle sequenze delle proteine ​​partner, tenendo conto delle loro strutture secondarie. Gli array utilizzati in questo protocollo sono stati Celluspots array preparati da INTAVIS bioanalitici Instruments. L&#39;array è bloccato per impedire il legame aspecifico e quindi incubate con la proteina studiata. Rilevamento utilizzando un anticorpo rivela i peptidi di legame corrispondenti ai siti specifici di interazione tra le proteine.

STIL è una proteina molto importante centrosomica. Controlla normale divisione cellulare e la proliferazione delle cellule 13,15 - 19. STIL interagisce con numerose proteine ​​18,20,21, e la maggior parte delle interazioni si verificano attraverso la sua parte centrale, che è una regione intrinsecamente disordinati (IDR) 14. Abbiamo progettato un array costituito da peptidi derivati ​​dalla proteina legante STIL CHFR. CHFR è un soppressore del tumore che è indotta in risposta...

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Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

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