Name: large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells
Uploaded: 2014-12-12T13:00:00
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这项工作是由国立法新社德拉RECHERCHE（Chercheuses的Jeunes / Chercheurs的Jeunes到EFN），基金会VOIR等Entendre和贝当古基金会舒尔勒（青年研究补助金，以EFN），中心法国国家科学研究（CNRS，为EFN永久位置）支持和健康（R01-EY13295到SCF）全国学院的国立眼科研究所。此外，研究所德拉视觉是由国家研究所德拉桑特等德拉RECHERCHE MEDICALE，UNIVERSITE皮埃尔与玛丽居里 - 巴黎6，中心法国国家科学研究和百货巴黎资助。

这个POS隔离实验是耗时且可能需要长达12小时来完成，如果POS存储之前被标记。该协议是改编自1987年31 1997年10由RS Molday和同事发表和修改SC Finnemann和同事的论文。 动物根据研究协会视觉与眼科（ARVO）声明的眼科和视觉研究使用动物的处理。协议进行了审查并批准了查尔斯·达尔文的道德委员会从大学的皮埃尔和玛丽·居里 - 巴黎06和Fordham大学机构动物护理和?...

三个步骤或条件是一个优化的纯化至关重要：梯度铸造细腻梯度管操纵质量，保持组织冷冻并在黑暗中直到收集步骤，抖视网膜匀浆的强度，从PR的其余部分获得适当的POS隔离细胞。如果有些问题出现在正确看到橙色的乐队，他们是由于三个原因大于1（另见结果部分的第二段），最有可能的。某些条件做一些修改是可能的，就像使用27 - 50％的蔗糖浓度梯度32或Optiprep步梯度<sup...

在视网膜，视力是由光敏分子，称为视蛋白，被转化成可在神经元之间向上传送到视觉区域在大脑中的信号之前的异构触发。这些分子被嵌入在叠层膜的磁盘类似，构成感光细胞外节的部分（PRS）的煎饼。受到恒定曝光，因此，相当大的水平的氧化应激，收受不断更新它们的外节段，以限制潜在的氧化损伤。光感受器外节是与相邻的视网膜色素上皮（RPE）细胞的顶端微绒毛紧密接触。视网膜色素上皮细胞构成的血-视网膜屏障的外部部分，并确保许多任务，这对于光感受器的健康和功能1是至关重要的，例如经由黑色素颜料，再异构化光反应视蛋白成分的视网膜，提供营养物和克淬火光线rowth因素，参与PR​​代谢产物处置。 此外，RPE细胞消除花费POS和回收它们的组件，一个由昼夜节律在哺乳动物视网膜2,3调节每日占领。棚的POS的间隙为PR生存绝对必要的。当它被完全废除，POS碎片累积和永久退化造成快速视力下降4,5。如果有节奏的配置文件丢失，通过不断的活动取代，PR和RPE缺陷积累与6岁。因此，这是非常重要的，以便了解表型与它的功能障碍以表征RPE吞噬作用的分子调控体外 。有趣的是，在视网膜色素上皮细胞的分子机制非常类似于使用由巨噬细胞清除凋亡细胞的1和两者都依赖于识别暴露磷脂酰丝氨酸上吞噬碎片7-9。仍然，RPE细胞和巨噬细胞调节pH值agocytosis不同，如巨噬细胞相遇时选择立即消除凋亡细胞的同时RPE细胞有节奏，每天吞噬POS只有一次，尽管他们与外节永久接触。这表明，还没有完全理解特定调节机制。 许多牵连的视网膜色素上皮细胞吞噬机械的分子已被确定或确认由于使用分离的POS和细胞培养物的吞噬作用测定法。与其配体MFG-E8位于RPE顶端细胞表面上的alphavbeta5整联蛋白受体，在协调，特异性结合的POS 10-12，其然后经由MERTK酪氨酸激酶受体13-15内在化。的CD36的清道夫受体已经显示参与POS摄取并影响其速度16,17，和可作为氧化磷脂在POS表面18的传感器。内在需要F-肌动蛋白细胞骨架屁股招聘ociated蛋白例如膜联 ​​蛋白2 19，肌球蛋白II 20和肌球蛋白VIIA 21,22。 体外天然或氧化的POS也利用来理解RPE细胞的体内连接于消化的不良氧化的POS 23-28中累积的衰老表现型。从干细胞的RPE细胞的产生已经开始对被用来证明细胞的功能它们被移植到动物或患者29,30,27之前孤立的POS一个新的应用程序。 首先由Molday和他的同事在1987年31所述，协议牛POS隔离结合连续蔗糖梯度与观察漂白视网膜感光色素的特点橙色外观的视网膜匀浆的超速离心步骤（携带11- 顺式视黄醛）。在过去的10年里，由于为了减少疯牛病的风险采取的预防措施，利用猪的眼睛已成为increasingly突出。这里所描述的协议说明如何获得从猪或牛的眼睛可以被等分并储存延长的时间段的大量的POS的。这样就无需从啮齿动物的眼睛，这需要使用大量POS每个准备和检测32,33,21,22动物准备POS。另外，使用荧光分子贮存前约POS标注细节给出，量化和可视化的POS中用于相对于吞噬测定32,10后的POS标签一些应用的简化和可比的方式。因此，这些大股允许再现性和易用性在许多不同类型的实验。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:108px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Specific Material/Equipment</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">2-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>gradient maker with 30-ml chambers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">3-mm diameter silicone tubing</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>tubing for gradient casting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">small size magnetic stir bar</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>stir bar fitting the gradient maker chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">red safelight lamp</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>inactinic lamp for dissection in the dark</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Clear 25x89 cm tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td>ultracentrifugation tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PP Oak Ridge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td>30-mL centrifugation tubes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima LE-80K&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>365668</td>
			<td>ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 32Ti swing rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>369694</td>
			<td>swing rotor for ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avanti J-26 XP</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393124</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-25.50 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>363058</td>
			<td>rotor for Avanti J-26 XP centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">FITC Isomer I</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>F-1906</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Other Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">counting chamber (such as Neubauer or Malassez)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dark ice buckets with lids</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scales</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stirrer and upholding pole</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">refrigated microcentrifuge</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">-80 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">labcoat</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Health and safety</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gloves</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sleeve protectors</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">googles</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">absorbent pads</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biohazard trash bags and bins</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades)</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm plastic dish</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile gauze sheets</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15- and 50-mL tubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>Common consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microtubes</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">aluminum foil</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale purification of porcine or bovine photoreceptor outer segments for phagocytosis assays on retinal pigment epithelial cells

可以在体外进行的视网膜色素上皮（RPE）细胞，光感受器外节（POS）的花费老化远端片段的吞噬的重要功能之一的分析。光感受器外节与栈含有光转机械膜质盘被连续更新的在视网膜上。花了POS是由视网膜色素上皮细胞每天淘汰。啮齿动物，猪/牛和人RPE细胞识别以类似的方式，从不同物种的POS。为了便于进行大系列很少变性的实验中，一个大的股票的POS可以从猪眼来分离和冷冻储存在等分试样。该协议需要时蒙在鼓里中显示橙色的感光色素的特性优势。在昏暗的红灯，视网膜被收集在从切成两半打开眼罩的缓冲区。视网膜细胞悬浮液均化，过滤，并上样到一个连续的蔗糖梯度。岑后trifugation，POS位于一个离散的频带中具有特性橙色渐变的上部。 POS然后收集，纺丝，在洗涤缓冲液再悬浮依次计数并等分。可用于吞噬作用测定法和蛋白激活，定位或相互作用的POS激发后的不同时间分析得到这样的POS。此外，POS可以标记荧光， 例如 ，FITC，等分的POS随后的荧光定量结合或吞噬之前。其他可能的应用包括使用改性的POS或POS挑战结合胁迫条件，研究氧化应激或RPE细胞老化的作用。

线性蔗糖梯度和超速离心的组合允许视网膜悬浮液密度的不同组分的分离。重较大的视网膜碎片和RPE细胞沉到或接近渐变（ 图2A）的底部。来自视网膜打火机POS和较轻的单个细胞或细胞碎片迁移作为单独的频带通过离心期间结束到达梯度的上半部分。通过保持眼睛和样品在黑暗中直到离心步骤后，含有的POS频带可立即通过其明亮的橙色颜色识别。该频带的宽度和强度取决于梯度质量?...

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Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

猪或牛光感受器外段的细胞吞噬分析对视网膜色素上皮细胞大规模纯化

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Research

JoVE Journal

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

鼠标应用结扎Peyer氏修补肠袢含量评价M细胞的细菌吸收

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

科研

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Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

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Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

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细胞凋亡细胞的吞噬作用<em&gt;果蝇</em&gt;胚胎

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

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以层流为基础的检测培养血管细胞和粘附血小板白细胞的研究

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

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The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...