Name: long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Merci à Willy Sun pour l&#39;assistance technique et le Dr Kris Gellynck pour leurs commentaires utiles et trois relecteurs anonymes pour leurs conseils constructifs. Ce travail a été financé par l&#39;Initiative de régénération d&#39;audience Sunnybrook

Tissu souris a été récolté à partir de Sox2 EGFP -reporter souris 12 maintenus et euthanasiés conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux sur pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. La culture embryonnaire cochlées <ol><li> Supplément milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) en mélangeant 8,89 ml de DMEM, 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 100 ul de 100x supplément N2, et 10 pi de 10 mg...

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Il ya plusieurs points techniques à prendre en compte lorsque les cultures sont établies et à mettre en place le microscope time-lapse pour que l&#39;imagerie à long terme. Nous utilisons sous-sol matrice de la membrane comme substrat pour la culture des explants cochléaires, mais le substrat doit être adapté au type de cellule. Par exemple, à l&#39;image des cultures de neurones, il peut être préférable de fournir un revêtement de fibronectine. La température d&#39;incubation e...

La cochlée des mammifères est un organe complexe très ordonnée. Chez la souris, entre l&#39;émergence de l&#39;oreille interne primitif de la vésicule otique le jour E11 et l&#39;achèvement du programme de développement à des stades postnatales, de multiples vagues de signalisation cellulaire et des changements coordonnés dans l&#39;expression génique ont lieu. Exécution de la base au sommet de la cochlée est la détection épithélium sensoriel, ou organe de Corti son. Développement de l&#39;organe de Corti est superbement contrôlé de telle sorte que d&#39;ici la fin du développement, il sera composé d&#39;une seule rangée de cellules ciliées internes, trois rangées de cellules ciliées externes entrecoupées de cinq rangées de cellules de soutien (deux rangées de cellules de pilier, trois des rangées de cellules de Deiters 1). Déviation de cette précises résultats d&#39;ordre dans la perte d&#39;audition, heighlighting l&#39;importance de studye DELA genèse et la structuration de la epithemlium sensorielle 2. Dans la culture in vitro de l&#39;embryon de souris cochLea est un outil essentiel dans l&#39;étude des mécanismes de développement de l&#39;organe de Corti. Cette technique a été créé en 1974 et au cours des 40 dernières années, a été utilisé pour élucider bon nombre des mécanismes par lesquels l&#39;épithélium sensoriel est spécifié et l&#39;organe de Corti établi 3. La cochlée est un organe complexe avec les processus dynamiques de développement; une manipulation peut prendre aussi longtemps que sept jours pour manifester 1. Par exemple, lors de l&#39;ajout d&#39;inhibiteurs de GSK 3β à une culture d&#39;explant cochléaire à E13, la période d&#39;incubation optimal pour observer un effet robuste du composé 4 est de six jours. Imagerie en temps réel de la cochlée développement permet l&#39;étude des changements dans la morphologie de l&#39;organe de Corti, les changements dans l&#39;expression des gènes, le suivi de migration, prolifération ou mourants cellules, et il permet d&#39;observer en temps réel les résultats des agents pharmaceutiques et la perturbation de la signalisation voies. Jusqu&#39;à présent, vivre l&#39;imagerie de la cochléea principalement été effectués en utilisant la microscopie confocale à l&#39;image de petites zones de l&#39;organe de Corti sur des périodes courtes 5-8, mais cette technique a des limites dues à la viabilité explant. Dans l&#39;imagerie des effets de manipulations à long terme sur les processus de développement lent, le milieu de formation d&#39;image est cruciale. Typiquement, un système d&#39;imagerie confocale en direct utilise une boîte en plastique humidifié qui se trouve sur le microscope. La chaleur et l&#39;humidité peuvent échapper à travers les lacunes dans la boîte incubation où il rencontre la table de microscope, à travers les fenêtres d&#39;accès, à travers les ouvertures à charnières et à travers les interstices autour des différentes parties de la microscope- comme la source de lumière ou objectif. Ce ne sont pas optimales pour le maintien en bonne santé explants pendant plus de deux ou trois jours. Nous définissons «incubateur microscope» comme un microscope inversé scellé à l&#39;intérieur d&#39;une norme incubateur à CO2, plutôt que d&#39;un incubateur construit autour du microscope. Un ex incubateur de microscopetend la vie de l&#39;expérience, de telle sorte que, plutôt que l&#39;imagerie sur deux ou trois jours, les échantillons peuvent être imagés par un maximum de deux semaines. Un microscope incubateur offre un excellent environnement pour la croissance et la différenciation cellulaire, avec une perturbation minimale de explantation des cultures et des conditions standard contrôlée. Dans les études qui se déroulent sur plusieurs jours, il est courant de recourir à des échantillons d&#39;imagerie sur une base quotidienne en les retirant de l&#39;incubateur et les portant à un microscope à fluorescence inversé. Bien que cette approche peut travailler, de sortir la vaisselle de l&#39;incubateur inflige une tension sur le tissu développement sensible. Les variations de l&#39;acidité du milieu de culture et les fluctuations de température dues à l&#39;enlèvement de l&#39;incubateur peuvent se traduire par le développement et des tissus sous-optimale malsain. L&#39;imagerie de la même région au même plan focal et dans la même orientation à chaque point de temps est extrêmement difficile. En utilisant un système automatisé à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur, il est possible de maintenir en bonne santétissu, de recueillir des images à plusieurs points dans le temps et à veiller à ce que la même zone est capturée dans chaque image. Au cours des dernières années, plusieurs incubateurs de tissus au microscope intégrés ont été développés, ceux-ci ont été utiles non seulement dans la pratique clinique 9 mais aussi sur les cellules souches et le cancer recherche 10,11. Nous présentons ici un protocole d&#39;imagerie en temps réel à long terme de embryonnaires explants cochléaires de la souris. On utilise un système de microscopie automatisée à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur à CO 2 standard qui est capable de capturer des images de plusieurs échantillons à des instants de consigne. Le système se compose d&#39;un microscope inversé posée dans un incubateur. Les échantillons sont placés dans une estrade tournante qui permet l&#39;imagerie d&#39;échantillons multiples à chaque point de temps. Illumination, capture d&#39;images, et la rotation de l&#39;estrade sont contrôlés par un système automatisé exploité par le logiciel Metamorph. En définissant une routine d&#39;imagerie utilisant le logiciel d&#39;exploitation, nous pouvons définir une expérience à fonctionner jusqu&#39;à two semaines avec une intervention humaine minimale. Dans cet exemple, nous utilisons deux champs lumineux et fluorescence d&#39;afficher une croissance à grande échelle et le réarrangement de la cochlée, et plus précisément, la région prosensory. Dans cette expérience, cochlée sera disséqué de souris rapporteurs Sox2 EGFP le jour embryonnaire E13. Cultures in vitro sera établi et imagé sur cinq jours.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Nous présentons ici une méthode à long terme imagerie time-lapse de direct embryonnaires explants cochléaires de la souris. Le programme de développement responsable de la construction de la très ordonnée, la structure complexe de la cochlée des mammifères produit une dizaine de jours. Afin d&#39;étudier les changements dans l&#39;expression des gènes au cours de cette période et leur réponse aux pharmaceutique ou manipulation génétique, l&#39;imagerie à long terme est nécessaire. Auparavant, l&#39;imagerie en temps réel a généralement été limitée par la viabilité des tissus expiantes dans une chambre humidifiée au sommet d&#39;un microscope standard. La difficulté dans le maintien des conditions optimales pour la croissance de la culture en ce qui concerne l&#39;humidité et la température a placé les limites de la longueur d&#39;expériences d&#39;imagerie. Un microscope intégré dans un incubateur de culture tissulaire modifié fournit un excellent environnement pour imagerie longue durée en direct. Dans cette méthode, nous démontrons comment établir explants cochléaires embryonnaires de souris et comment utiliser un microscope incubateur de mener laps de temps Imaging utilisant à la fois champ lumineux et la microscopie à fluorescence pour examiner le comportement d&#39;une journée typique embryonnaire (E) 13 explant cochléaire et Sox2, un marqueur des cellules prosensory de la cochlée, sur 5 jours.

Ici, nous montrons un montage (figure 1) et un film (Figure 2) montrant comment un explant cochléaire organotypique typique va croître si plaqué sur E13.5. Un journaliste souris Sox2 a été utilisé pour visualiser la région prosensory. Le film montre que la cochlée est soumis à une croissance et à la convergence et l&#39;extension, les cellules dans la région latérale du domaine de Sox2 vert ne semblent pas se diviser le tissu environnant comme il se dilate....

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Imagerie en temps réel de la cochlée des mammifères embryonnaire est difficile parce que les processus de développement de la main fonctionnent sur un gradient temporel de plus de dix jours. Nous présentons ici une méthode pour la culture et l&#39;imagerie des tissus embryonnaires des explants cochléaire pris d&#39;une souris rapporteur fluorescent sur cinq jours.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

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