Name: long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Grazie a Willy Sun per l&#39;assistenza tecnica e il Dr. Kris Gellynck per gli utili commenti e tre revisori anonimi per i loro consigli costruttivi. Questo lavoro è stato finanziato dalla udienza Regeneration Initiative Sunnybrook

Tessuto mouse è stato raccolto da Sox2 EGFP -reporter topi 12 mantenuti e eutanasia ai sensi del canadese sugli orientamenti per la cura degli animali per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Coltura embrionale coclee <ol><li> Supplemento Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) miscelando 8,89 ml di DMEM, 1 ml di siero fetale bovino (FBS), 100 ml di 100x N2 integratore, e 10 ml di 10 mg / ml ciprofloxacina. Supplemento soluzione salina bilanciata ...

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Ci sono diversi punti tecnici da considerare quando le culture sono stabiliti e nella creazione del microscopio time-lapse in modo per l&#39;imaging a lungo termine. Usiamo matrice di membrana basale come substrato per la coltura di espianti cocleari, ma il supporto deve essere adattato al tipo di cellula. Ad esempio, per colture neuronali di immagine, può essere meglio per fornire un rivestimento fibronectina. Temperatura di incubazione e la composizione del gas dovrebbero essere scelti in...

La coclea dei mammiferi è un organo complesso altamente ordinato. Nel topo, tra l&#39;emergere dell&#39;orecchio interno primitiva vescicola otica del giorno E11 e il completamento del programma di sviluppo nelle fasi postnatali precoci, più ondate di segnalazione cellulare e cambiamenti coordinati nell&#39;espressione genica hanno luogo. Esecuzione dalla base all&#39;apice del condotto cocleare è il suono di rilevamento epitelio sensoriale, o l&#39;organo del Corti. Sviluppo dell&#39;organo del Corti è squisitamente controllato in modo tale che entro la fine dello sviluppo, che sarà composto da una sola fila di cellule ciliate interne, tre file di cellule ciliate esterne intervallate da cinque file di cellule di supporto (due file di celle pilastro, tre file di celle Deiters &#39;) 1. Deviazione da questo preciso ordine si traduce in perdita di udito, heighlighting l&#39;importanza di studye Ofthe genesi e patterning del epithemlium sensoriale 2. In coltura in vitro del mouse Coch embrionalelea è uno strumento essenziale per lo studio dei meccanismi di sviluppo dell&#39;organo del Corti. Questa tecnica è stata fondata nel 1974 e nel corso degli ultimi 40 anni, è stato utilizzato per chiarire molti dei meccanismi attraverso i quali è specificato l&#39;epitelio sensoriale e l&#39;organo del Corti stabilito 3. La coclea è un organo complesso con processi di sviluppo dinamici; una manipolazione può richiedere fino a sette giorni per manifestare 1. Ad esempio, quando si aggiunge inibitori GSK 3β ad una cultura espianto cocleare a E13, il periodo di incubazione ottimale per osservare un effetto robusto del composto è di sei giorni 4. Immagini dal vivo della coclea in via di sviluppo permette di indagine in cambiamenti nella morfologia dell&#39;organo del Corti, cambiamenti di espressione genica, il monitoraggio di migrazione, proliferazione o morenti cellule, e permette l&#39;osservazione in tempo reale dei risultati di agenti farmaceutici e la rottura di segnalazione percorsi. Fino ad ora, vivere l&#39;imaging della cocleaè stata principalmente effettuata mediante microscopia confocale a immagini piccole aree dell&#39;organo del Corti in periodi di tempo brevi 5-8, ma questa tecnica ha dei limiti dovuti alla redditività espianto. Nelle immagini degli effetti delle manipolazioni a lungo termine sui processi evolutivi lenti, l&#39;ambiente di imaging è cruciale. Tipicamente un sistema di imaging vivo confocale utilizza una scatola di plastica umidificata che siede sul microscopio. Calore e umidità possono sfuggire attraverso le fessure nella scatola incubazione dove incontra il tavolo microscopio, attraverso le finestre di accesso, attraverso le aperture a battente e attraverso le aperture intorno varie parti del Microscopio quali l&#39;obiettivo o della sorgente luminosa. Questo non è ottimale per mantenere espianti sani per più di due o tre giorni. Definiamo &#39;microscopio incubatore&#39; come un microscopio invertito sigillato all&#39;interno di un livello di CO 2 incubatore, piuttosto che un incubatore costruito intorno al microscopio. Un microscopio incubatore extende la durata dell&#39;esperimento tale che piuttosto che l&#39;imaging in due o tre giorni, i campioni possono essere esposte per due settimane. Un microscopio incubatore fornisce un ottimo ambiente per la crescita cellulare e la differenziazione, con il minimo disturbo per espiantare le culture e le condizioni standard controllato. Negli studi che si svolgono su più giorni è comune ricorrere a campioni di imaging quotidianamente rimuovendoli dal termostato e li trasporta ad un microscopio a fluorescenza invertito. Anche se questo approccio può funzionare, di estrarre le stoviglie dal termostato infligge stress sul tessuto in via di sviluppo sensibile. Variazioni acidità del mezzo di coltura e le fluttuazioni di temperatura dovuto alla rimozione dal termostato può provocare lo sviluppo ottimale e tessuto sano. Imaging stessa regione nello stesso piano focale e nello stesso orientamento in ogni punto temporale è estremamente impegnativo. Utilizzando un sistema automatizzato all&#39;interno di un incubatore, è possibile mantenere in buona salutetessuti, per raccogliere le immagini a più punti di tempo e di garantire che la stessa area viene catturato in ogni fotogramma. Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi incubatori tessuto microscopio integrati, questi sono stati utili non solo nella pratica clinica 9 ma anche in cellule staminali e cancro ricerche 10,11. Qui vi presentiamo un protocollo per il lungo termine l&#39;imaging dal vivo di espianti embrionali del mouse cocleari. Usiamo un sistema di microscopia automatizzata all&#39;interno di un incubatore CO 2 standard che ha la capacità di catturare immagini di più campioni in momenti insieme. Il sistema è costituito da un microscopio invertito impostato all&#39;interno di un incubatore. I campioni sono collocati in una pedana rotante che permette l&#39;imaging di campioni multipli ad ogni tempo. Illuminazione, l&#39;acquisizione di immagini e la rotazione della pedana sono controllati da un sistema automatico gestito tramite software Metamorph. Impostando una routine di imaging con il software operativo possiamo impostare un esperimento di correre per un massimo di two settimane con minimo intervento umano. In questo esempio si usa sia in campo chiaro e fluorescenza a mostrare una crescita su larga scala e riarrangiamento della coclea, e, in particolare, la regione prosensory. In questo esperimento, coclee verrà sezionato da Sox2 EGFP topi reporter del giorno embrionale E13. Sarà stabilita culture in vitro e poi ripreso nel corso di cinque giorni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Qui vi presentiamo un metodo a lungo termine time-lapse imaging dal vivo espianti del mouse cocleari embrionali. Il programma di sviluppo responsabile della costruzione altamente ordinata, complessa struttura dei proventi coclea di mammifero per una decina di giorni. Al fine di studiare i cambiamenti nell&#39;espressione genica in questo periodo e la loro risposta alla farmaceutica o la manipolazione genetica, l&#39;imaging a lungo termine è necessario. In precedenza, l&#39;imaging in tempo reale è tipicamente stata limitata dalla redditività del tessuto espiantato in una camera umidificata cima a un microscopio standard. Difficoltà nel mantenere condizioni ottimali per la crescita della cultura in materia di umidità e temperatura ha posto limiti alla lunghezza di esperimenti di imaging. Un microscopio integrato in una coltura di tessuti incubatore modificato fornisce un ambiente ideale per l&#39;imaging a lungo termine-live. In questo metodo si dimostra come stabilire embrionali di topo espianti cocleari e come utilizzare un microscopio incubatore per condurre lasso di tempo Imaging utilizzando sia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza per esaminare il comportamento di una tipica giornata embrionale (E) 13 espianto cocleare e Sox2, un marker delle cellule prosensory della coclea, su 5 giorni.

Qui vi mostriamo un montaggio (Figura 1) e un film (Figura 2), a dimostrazione di come un tipico espianto cocleare organotipica crescerà se placcato su E13.5. Un Sox2 topo reporter è stato utilizzato per visualizzare la regione prosensory. Il film illustra che la coclea subisce crescita e la convergenza ed estensione, le cellule nella zona laterale del dominio Sox2 verde non sembrano dividere il tessuto circostante si espande. Questa è una caratteristica dell&#39;or...

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell&#39;arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l&#39;imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

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