Name: long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00
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有益なコメントとその建設的な助言のための3つの匿名査読のために技術支援のためのウィリー日博士とクリスGellynckに感謝します。この作業は、サニーブルック聴覚回生イニシアチブによって資金を供給された

マウス組織をマウス12実験動物のケアと使用のための動物実験ガイドラインにカナダ人評議会に従って維持し、安楽死させ-reporter Sox2のEGFPから収穫した。 1.培養胚蝸牛<ol><li> 、DMEMを8.89ミリリットルを混合することにより、ウシ胎児血清（FBS）、100×N2サプリメントを100μl、及び10mg / mlのシプロフロキサシンの10μlを1mlのをダルベッコ改変イーグル?...

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	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

培養物を確立し、長期的画像化するためにタイムラプス顕微鏡を設定する際にされているときに考慮すべきいくつかの技術的なポイントがある。 我々は、蝸牛外植片を培養するための基質として基底膜マトリックスを使用するが、基質は、細胞型に適合させるべきである。例えば、画像ニューロン培養物には、フィブロネクチンのコーティングを提供することが望まし?...

哺乳類の蝸牛は非常に規則正しい複雑な器官である。出生後早期の段階での日に耳胞からプリミティブ内耳の出現E11と発達プログラムの完了との間に、マウスでは、細胞のシグナル伝達および遺伝子発現の協調変化の複数の波が起こる。ベースから蝸牛管の頂点に実行すると、感覚上皮を検出する音、またはコルチ器官である。コルチ器官の開発は絶妙開発の終わりまでには、内有毛細胞の単一の行で構成されように制御され、外有毛細胞の3つの行は、支持細胞の5行（柱状セルの二行三に散在ダイテルス「セルの行）1。 、難聴起源感覚epithemlium 2のパターニングofthe studyeの重要性をheighlightingでこの正確な順序結果からの偏差。 胚性マウスCOCHの体外培養においてLEAは、コルチ器官の発達のメカニズムを研究する上で不可欠なツールです。この技術は1974年に設立され、過去40年間で、感覚上皮が指定され、コルチ器官は3が確立されたメカニズムの多くを解明するために使用されてきた。蝸牛は、動的な発生過程との複雑な器官である。操作1をマニフェストに限り、7日間かかる場合があります。 E13での蝸牛外植片培養物にGSK3βの阻害剤を追加する場合、例えば、化合物の強固な効果を観察するための最適なインキュベーション期間の6日4である。 現像蝸牛のライブイメージングは​​、コルチ器官の形態の変化、遺伝子発現の変化、細胞を、移行増殖性または死亡の追跡調査を可能にし、それはリアルタイム薬剤の結果の観察およびシグナリングの中断を可能にする経路。今までは、蝸牛のイメージングを生きる主に短時間5-8上コルチ器官の画像小領域に、共焦点顕微鏡を使用して実行するが、この技術は、外植片生存率による制限を有するされている。遅い発達プロセスにおける長期的な操作の効果の撮影では、撮影環境が重要である。通常、共焦点ライブイメージング·システムは、顕微鏡に座って、加湿プラスチックの箱を使用しています。暑さと湿度は、アクセス窓から、ヒンジ付きの開口部を通って、そのような客観的または光源としてmicroscope-のさまざまな部分の周りの隙間を通って、顕微鏡テーブルを満たすインキュベートボックス内の隙間を通って逃げることができる。これは、2つまたは3つ以上日間健康な外植片を維持するために最適ではない。 我々は、標準的なCO 2インキュベータ内に封入され、倒立顕微鏡ではなく、顕微鏡を中心に構築され、インキュベーターとして「インキュベーター顕微鏡&#39;を定義。インキュベーター顕微鏡事後むしろ二、三日間のイメージングより、サンプルは2週間まで撮像することができるように、実験の寿命がある。インキュベーター顕微鏡は文化や標準制御された条件を外植する最小限の妨害で、細胞の増殖および分化のための優れた環境を提供します。複数日にわたって行われた研究では、培養器からそれらを除去し、倒立蛍光顕微鏡にそれらを実施することによって、日常的に画像化サンプルに頼るのが一般的である。このアプローチは働くことができる一方で、インキュベータから皿を除去することに敏感な開発組織のストレスを負わせる。原因インキュベーターから取り出し、温度における培養培地および変動の酸性度の変化は、次善の開発や不健康な組織になることができます。あらゆる時点において同じ焦点面と同じ方向に同じ領域を撮像することは極めて困難である。インキュベータ内で自動化システムを使用することにより、健康維持することができる組織は、複数の時点での画像を収集するために、同じ領域が全てのフレームに取り込まれることを確実にする。近年、いくつかの統合された顕微鏡組織インキュベーターが開発されており、これらは、臨床診療9にも、幹細胞および癌研究10,11のみならず、有用であった。 ここでは、マウス胎児蝸牛外植片の長期ライブイメージングのためのプロトコルを提示する。我々は、設定された時点で複数のサンプルの画像を捕捉する能力を有する標準的なCO 2インキュベータの内部に自動顕微鏡システムを使用する。システムは、インキュベータ内にセットし、倒立顕微鏡で構成されています。サンプルは、各時点で複数のサンプルの画像化を可能にする回転壇上に配置されている。照明、画像キャプチャ、および演壇の回転は、MetaMorphソフトウェアを介して操作の自動化システムによって制御される。オペレーティングソフトウェアを用いた撮像ルーチンを設定することにより、我々は、twの最大のために実行するための実験を​​設定することができ最小限の人間の介入と週O。この例では、大規模な成長と転位蝸牛の、具体的には、prosensory領域を示すために、明視野および蛍光の両方を使用する。この実験では、蝸牛は胎生E13にSox2のEGFPレポーターマウスから解剖されます。 インビトロ培養が確立した後、5日間にわたり画像化されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

ここでは、ライブ胚のマウス蝸牛外植片の長期的なタイムラプスイメージングのための方法を提示する。約10日間の哺乳類蝸牛が進むの非常に規則正しい、複雑な構造を構築するための責任が発生プログラム。この期間にわたって遺伝子発現の変化および医薬品または遺伝子操作に対する反応を研究するために、長期的画像化が必要である。以前は、ライブイメージングは​​、典型的には、標準的な顕微鏡の上の加湿チャンバー内で移植組織の生存度によって制限されてきた。湿度および温度に関して培養増殖のための最適な条件を維持することが困難で画像化実験の長さに制限を置いている。修正された組織培養インキュベーターに統合顕微鏡は、長期的なライブイメージングのための優れた環境を提供します。この方法では、我々はマウス胎児蝸牛外植片を確立する方法と時間経過のimagiを実施するインキュベーター顕微鏡を使用する方法を示し5日間にわたり、典型的な胚日（E）13蝸牛外植片及びSox2の、蝸牛のprosensory細胞のマーカーの挙動を調べるために、明視野および蛍光顕微鏡の両方を使用してngの。

ここでは、モンタージュ（ 図1）およびE13.5上に播種した場合、典型的な器官蝸牛外植片が成長する方法を示す映画（ 図2）を示す。 Sox2のレポーターマウスprosensory領域を可視化するために使用された。映画は蝸牛成長と収束と拡張子を受けることを示し、緑のSox2のドメインの横の領域内のセルは、それが拡大し、周囲の組織のように分割していないよ?...

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

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マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

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Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

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の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

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胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

神経フリーの生成と長期維持<em&gt;ヒドラ</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

自由に行動するマウスで長期的な感覚の衝突

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...