Name: identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis
Uploaded: 2014-11-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis at JoVE.com

JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund&#8212;Memorial Hermann Foundation.

1. EML cultura de células e separação das células CD34 + Lin-Lin e-CD34 @ Usar celular Magnetic Classificando Sistema e fluorescência-ativado celular método de classificação <ol><li> Preparação de bebê de rim de hamster (BHK) meio de cultura de células-tronco para coleta de fator de célula: <ol><li> Cultura de células BHK em meio DMEM contendo 10% de FBS em balão de 25cm 2 (Tabela 1), a 37 ° C, 5% de CO 2 num incubador de cultura de células. </li><li> Quando as c...

<ol>
	<li>Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+aging:+wrinkles+in+stem+cell+potential.">Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential.</a> Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line.">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS genetics. 8, (2012).</li><li>Ye, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+in+EML+cell+stimulation+by+stem+cell+factor+and+IL-3.">Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).</li><li>Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+progenitors+immortalized+by+a+retroviral+vector+harboring+a+dominant-negative+retinoic+acid+receptor+can+recapitulate+lymphoid,+myeloid,+and+erythroid+development.">Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development.</a> Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).</li><li>Weiler, S. 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C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data.">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li><li>Glenn, T. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones.">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li><li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. 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Transcriptoma de mamíferos é muito complexo 34-38. Tecnologia de RNA-Seq desempenha um papel cada vez mais importante nos estudos de análise de transcriptoma, novela de detecção de transcrições e único nucleotídeo descoberta variação etc. Ele tem muitas vantagens sobre outros métodos de análise de expressão gênica. Como mencionado na introdução, que supera os artefactos de hibridação de microarray e pode ser utilizado para identificar novos transcritos de de novo. U...

As células estaminais hematopoiéticas são células sanguíneas raras que residem principalmente no nicho da medula óssea de adultos. Eles são responsáveis ​​pela produção de células necessárias para a reconstituição do sangue e os sistemas imunitários 1. Como um tipo de células estaminais, HSCs são capazes de tanto a auto-renovação e diferenciação. Elucidar os mecanismos que controlam a decisão destino de HSCs, direção ou auto-renovação ou diferenciação, vai oferecer orientações valiosas sobre a manipulação de HSCs para pesquisas de doenças de sangue e uso clínico 2. Um problema enfrentado pelos pesquisadores é que HSCs podem ser mantidas e expandidas in vitro de forma muito limitada; a grande maioria dos seus descendentes são parcialmente diferenciadas em cultura 2. A fim de identificar os principais reguladores que controlam os processos de auto-renovação e diferenciação em uma escala de todo o genoma, foi utilizada uma linha primitiva de células progenitoras hematopoiéticas do rato EML como um sistema modelo. Thé A linha celular foi derivada a partir de 3,4 medula óssea de murino. Quando alimentados com diferentes factores de crescimento, as células podem diferenciar-se em EML eritróide, mielóide, e células linfóides in vitro, 5. É importante notar que esta linhagem celular pode ser propagada em grande quantidade no meio de cultura contendo factor de células estaminais (SCF) e ainda reter a sua multipotencialidade. Células EML podem ser separados em subpopulações de auto-renovação Lin-SCA + CD34 + e parcialmente diferenciadas células Lin-SCA-CD34 @ com base em marcadores de superfície CD34 e SCA 6. Semelhante a curto prazo HSCs, SCA + CD34 + células são capazes de auto-renovação. Quando tratados com células CD34 + SCF, Lin-SCA + pode regenerar rapidamente uma população mista de células CD34 + e Lin-SCA-CD34 @ Lin-SCA + e continuam a proliferar 6. As duas populações são semelhantes na morfologia e têm níveis semelhantes de ARNm de c-kit e proteína 6. Células Lin-SCA-CD34 @ são capazes de propagar em meios contendo IL-3 em vez de SCF 3. Unveiling principais reguladores da EML decisão destino celular vai oferecer melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares em transição inicial de desenvolvimento durante a hematopoiese. A fim de investigar as diferenças moleculares subjacentes entre a auto-renovação de células Lin-SCA-CD34 @ parcialmente diferenciados Lin-SCA + CD34 + e, usamos RNA-Seq para identificar genes diferencialmente expressos. Em particular, vamos nos concentrar em fatores de transcrição, como fatores de transcrição são cruciais na determinação do destino da célula. RNA-Seq é uma abordagem desenvolvida recentemente, que utiliza as capacidades de sequenciamento de próxima geração (NGS) tecnologias para o perfil e quantificar RNAs transcritos do genoma 7,8. Em resumo, o ARN total é poli-A e fragmentada seleccionado como o modelo template.The ARN inicial é então convertido em cDNA usando transcriptase reversa. De modo a mapear full-length transcritos de ARN, utilizando, ARN não degradado intacta para a construção da biblioteca de cDNA é importante. Para o purrepresentar de sequenciamento, as sequências adaptadoras específicos são adicionados a ambas as extremidades do cDNA. Em seguida, na maioria dos casos, as moléculas de ADNc são amplificados por PCR e sequenciado de uma forma de alto rendimento. Após o seqüenciamento, a resultante leituras podem ser alinhados com um genoma de referência e um banco de dados de transcriptoma. O número de leituras que mapeiam para o gene de referência é contada e essa informação pode ser usada para estimar o nível de expressão do gene. A lê também podem ser montados, de novo sem um genoma de referência, permitindo que o estudo de transcriptomes em organismos modelo não-9. Tecnologia de RNA-seq também tem sido usado para detectar as isoformas de splicing, 10-12 novos transcritos 13 e 14 fusões de genes. Em adição à detecção de genes codificadores de proteínas, o RNA-Seq também pode ser usada para detectar e analisar romance nível de transcrição de RNAs não-codificantes, tais como longa não codificante de ARN 15,16, microARN 17, 18, ​​etc siRNA. Por causa de tele precisão deste método, tem sido utilizado para a detecção de variações de nucleótidos simples 19,20. Antes do advento da tecnologia de RNA-Seq, microarray foi o principal método utilizado para analisar o perfil de expressão do gene. Pré-concebidas sondas são sintetizados e subsequentemente ligado a uma superfície sólida para formar uma lâmina de microarray 21. ARNm é extraído e convertido em cDNA. Durante o processo de transcrição reversa, os nucleótidos marcados com fluorescência são incorporados no cDNA e o cDNA pode ser hibridado nas lâminas de microarray. A intensidade do sinal recolhido a partir de um ponto específico depende da quantidade de ADNc de ligação com a sonda específica naquele ponto 21. Em comparação com a tecnologia de RNA-Seq, microarray tem várias limitações. Primeiro, microarray confia no conhecimento pré-existente de anotação de genes, enquanto a tecnologia de RNA-Seq é capaz de detectar novas transcrições em alto nível de fundo relativa, o que limita a sua utilização quando a GEnível de expressão ne é baixo. Além disso, a tecnologia de RNA-Seq tem muito maior alcance dinâmico de detecção (8.000 vezes) 7, que, devido ao fundo e saturação dos sinais, a precisão de microarray é limitado para ambos os genes altamente expressos e humilde 7,22. Finalmente, as sondas de microarranjo diferem em suas eficiências de hibridização, que tornam os resultados menos confiáveis ​​quando se comparam os níveis de expressão relativos de diferentes transcritos dentro de uma amostra de 23. Embora RNA-Seq tem muitas vantagens sobre microarranjo, a análise de dados é complexo. Esta é uma das razões que muitos pesquisadores ainda usam microarray em vez de RNA-Seq. Várias ferramentas de bioinformática são necessários para o processamento de dados de RNA-Seq e análise 24. Entre vários sequenciamento de próxima geração (NGS) plataformas, 454, Illumina, SOLID e Ion Torrent são os mais utilizados. 454 foi a primeira plataforma de NGS comercial. Em contraste com as outras plataformas de sequenciaçãocomprimento como illumina e sólida, a plataforma 454 gera mais ler (em média 700 base de leituras) 25. Lê mais são melhores para a caracterização inicial de transcriptiome devido à sua maior eficiência montar 25. A principal desvantagem da plataforma 454 é o seu custo elevado por megabases de sequência. A Illumina e plataformas SÓLIDOS gerar lê com aumento e comprimentos curtos. O custo por megabases de sequência é muito mais baixa do que a plataforma 454. Devido ao grande número de curta lê para a Illumina e plataformas SÓLIDOS, análise de dados é muito mais computacionalmente intensivo. O preço do instrumento e reagentes para sequenciamento para a plataforma Ion Torrent é mais barato eo tempo de seqüenciamento é mais curto 25. No entanto, a taxa de erro e o custo por megabases de sequência são mais elevados em comparação com o Ilumina e plataformas SÓLIDOS. Plataformas diferentes têm suas próprias vantagens e desvantagens e exigem métodos diferentes para análise de dados. O plaTForm deve ser escolhido com base na finalidade de seqüenciamento e da disponibilidade de financiamento. Neste artigo, tomamos plataforma Illumina RNA-Seq como um exemplo. Utilizou-se EML célula como um sistema modelo para investigar os reguladores-chave na EML celular auto-renovação e diferenciação, e fornecida uma métodos detalhados de construção da biblioteca de ARN-Seq e análise de dados para o cálculo do nível de expressão e detecção de novo transcrito. Temos mostrado na nossa publicação anterior que estudo RNA-seq no sistema modelo EML 2, quando acoplado com teste funcional (por exemplo, shRNA knockdown) proporcionar uma abordagem poderosa para compreender o mecanismo molecular dos primeiros estágios de diferenciação hematopoiética, e pode servir como um modelo para a análise de células de auto-renovação e diferenciação em geral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD34 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Lineage Antibody Cocktail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558074</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special offer sysmtem</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 75cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 25cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068-015</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140071</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30228.02</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Isolation of lineage negative cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoVue Plus spectrophotometer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9569-62</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482; Napco&#8482; 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-497-002&#160;</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#174; Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>RNA exraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq&#8482; RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2002</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis

As células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são utilizados clinicamente para o tratamento de transplante para reconstruir o sistema hematopoiético de um paciente em muitas doenças, tais como leucemia e linfoma. Elucidação dos mecanismos que controlam HSCs auto-renovação e diferenciação é importante para a aplicação de HSCs para a pesquisa e usos clínicos. No entanto, não é possível obter grande quantidade de HSCs, devido à sua incapacidade para proliferar in vitro. Para superar este obstáculo, foi utilizada uma linha de células derivadas da medula óssea do rato, a linhagem de células EML (eritróide, mielóide e linfóide), como um sistema modelo para este estudo. RNA-seqüenciamento (RNA-Seq) tem sido cada vez mais usado para substituir microarray para estudos de expressão gênica. Nós relatamos aqui um método detalhado do uso da tecnologia de RNA-Seq para investigar os possíveis fatores-chave na regulação da célula EML auto-renovação e diferenciação. O protocolo fornecido neste artigo está dividido em três partes. O primeiro part explica como a cultura de células de EML e separado Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. A segunda parte do protocolo oferece procedimentos detalhados para a preparação total de RNA ea construção da biblioteca para posterior de alto rendimento de sequenciamento. A última parte descreve o método para análise de dados de RNA-Seq e explica como usar os dados para identificar fatores de transcrição diferencialmente expressos entre Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. Os fatores de transcrição mais significativamente diferencialmente expressos foram identificados como sendo os possíveis reguladores chave que controlam as células EML auto-renovação e diferenciação. Na discussão deste trabalho, destacamos as principais etapas para um desempenho de sucesso desta experiência. Em resumo, este trabalho oferece um método de usar a tecnologia de RNA-Seq para identificar potenciais reguladores de auto-renovação e diferenciação em células EML. Os principais fatores identificados são submetidos à análise funcional jusante in vitro e in vivo.

A fim de analisar os genes diferencialmente expressos em Lin-CD34 + e CD34- células Lin-EML, usamos a tecnologia de RNA-Seq. A Figura 1 mostra o fluxo dos procedimentos. Após o isolamento das células de linhagem negativos por separação de células magnéticas, nós separamos as células Lin-SCA-CD34 @ usando FACS Aria Lin-SCA + CD34 + e. Células EML Lin enriquecidas foram marcadas com anti-CD34, anti-Sca1 e anticorpos cocktail de linhagem. Apenas as células Lin- foram fechado para a análise de S...

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Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologia

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Ensaio Reporter para o Estudo de genes que regulam o mouse Manutenção células-tronco embrionárias e auto-renovação

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...