Name: identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis
Uploaded: 2014-11-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis at JoVE.com

JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund&#8212;Memorial Hermann Foundation.

1. EML Hücre Kültürü ve Sistem ve sıralama Manyetik Hücre kullanma Lin-CD34 + ve Lin-CD34 Hücrelerinin Ayırma Floresan aktive Hücre Ayırma Yöntemi <ol><li> Kök hücre faktörü toplanması için bebek hamster böbrek (BHK) hücre kültür ortamının hazırlanması: <ol><li> 37 ° C&#39;de bir hücre kültürü inkübatöründe,% 5 CO2 seviyesinde 25 cm2 bir şişede (Tablo 1)% 10 FBS içeren DMEM aracı madde içinde kültür BHK hücreleri. </li><li> Hücreler 80 ge...

<ol>
	<li>Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+aging:+wrinkles+in+stem+cell+potential.">Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential.</a> Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line.">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS genetics. 8, (2012).</li><li>Ye, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interactions+in+EML+cell+stimulation+by+stem+cell+factor+and+IL-3.">Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).</li><li>Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+progenitors+immortalized+by+a+retroviral+vector+harboring+a+dominant-negative+retinoic+acid+receptor+can+recapitulate+lymphoid,+myeloid,+and+erythroid+development.">Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development.</a> Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).</li><li>Weiler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D3:+a+gene+induced+during+myeloid+cell+differentiation+of+Linlo+c-Kit++Sca-1(+)+progenitor+cells.">D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells.</a> Blood. 93, 527-536 (1999).</li><li>Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+precursor+cells+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line.">Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li><li>Chu, Y., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+platform+selection,+experimental+design,+and+data+interpretation.">RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation.</a> Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).</li><li>Hornett, E. A., Wheat, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RNA-Seq+analysis+in+non-model+species:+assessing+transcriptome+assemblies+as+a+scaffold+and+the+utility+of+evolutionary+divergent+genomic+reference+species.">Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species.</a> BMC genomics. 13, 361 (2012).</li><li>Eswaran, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+cancer+reveals+novel+splicing+alterations.">RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations.</a> Scientific reports. 3, 1689 (2013).</li><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptomes+during+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+revealed+by+short,+long,+and+paired-end+sequencing.">Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).</li><li>Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+of+Arabidopsis+pollen+uncovers+novel+transcription+and+alternative+splicing.">RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing.</a> Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).</li><li>Edgren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fusion+genes+in+breast+cancer+by+paired-end+RNA-sequencing.">Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.</a> Genome biology. 12, 6 (2011).</li><li>Ilott, N. E., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+long+non-coding+RNAs+using+RNA+sequencing.">Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing.</a> Methods. 63, 50-59 (2013).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+novel+long+non-coding+RNAs+based+on+RNA-Seq+data+of+mouse+Klf1+knockout+study.">Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study.</a> BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).</li><li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform.">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).</li><li>Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sequencing+of+the+siRNAs+associated+with+peach+latent+mosaic+viroid+infection.">In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection.</a> BMC molecular biology. 11, 16 (2010).</li><li>Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+nucleotide+variations+in+expressed+exons+of+the+human+genome+using+RNA-Seq.">Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq.</a> Nucleic acids research. 37, 106 (2009).</li><li>Djari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-based+single+nucleotide+polymorphism+discovery+in+bovine+muscle+using+next-generation+transcriptomic+sequencing.">Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing.</a> BMC genomics. 14, 307 (2013).</li><li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+studies+using+microarrays:+principles,+problems,+and+prospects.">Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects.</a> Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+characterization+of+spinal+cord+injury+transcriptome+in+acute/subacute+phases:+a+resource+for+understanding+the+pathology+at+the+systems+level.">RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level.</a> PLoS one. 8, 72567 (2013).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome research. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+analyze+gene+expression+using+RNA-sequencing+data.">How to analyze gene expression using RNA-sequencing data.</a> Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).</li><li>Glenn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+guide+to+next-generation+DNA+sequencers.">Field guide to next-generation DNA sequencers.</a> Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nature protocols. 7, 562-578 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome biology. 10, 25 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nature. 28, 511-515 (2010).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome biology. 11, 106 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Cheranova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+transcriptomes+in+thrombin-treated+and+control+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AnimalTFDB:+a+comprehensive+animal+transcription+factor+database.">AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database.</a> Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+transcribed+loci+in+ENCODE+regions+using+RACE+sequencing+reveals+extensive+transcription+in+the+human+genome.">Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome.</a> Genome Biol. 9, 3 (2008).</li><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+RT-PCR+recovery+of+full-length+cDNA+clones.">Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones.</a> Biotechniques. 36, 690-696 (2004).</li><li>Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rat+genes+by+TWINSCAN+gene+prediction,+RT-PCR,+and+direct+sequencing.">Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing.</a> Genome Res. 14, 665-671 (2004).</li><li>Dewey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+identification+of+novel+human+genes+through+simultaneous+gene+prediction+in+human,+mouse,+and+rat.">Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat.</a> Genome Res. 14, 661-664 (2004).</li><li>Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).</li></ol>

Memeli transcriptome 34-38 çok karmaşık. RNA-Seq teknoloji It gen ifadesi analizi için diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır transcriptome analizi, roman transkript tespiti ve tek nükleotid varyasyon keşif vb çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Girişte de belirtildiği gibi, mikrodizi hibridizasyon eserler üstesinden gelir ve yeni bir transkript de novo tanımlamak için kullanılabilir. RNA-sıralamasının bir sınırlama Sanger dizileme karşıla?...

Hematopoetik kök hücreler erişkin kemik iliği niş ağırlıklı olarak ikamet nadir kan hücreleridir. Bunlar, kan yeniden doldurmak için gereken hücreleri ve immün sistem 1 üretimi için sorumludur. Kök hücrelerin bir tür olarak, HSC kendini yenileme ve farklılaşma kabiliyetine sahip bulunmaktadır. HKH&#39;lerin kaderi kararını kontrol mekanizmaların tanıtılması, kendini yenileme veya farklılaşma ya doğru, kan hastalığı araştırmalar ve klinik kullanım için 2 HKH&#39;lerin manipülasyon değerli rehberlik sunacak. Araştırmacılar tarafından karşılaşılan bir sorun, HSC muhafaza ve çok sınırlı bir ölçüde, in vitro olarak genişletilebilir olabilir; soylarına büyük çoğunluğu kısmen kültür 2 ayrıştırılmıştır. Genom ölçeğinde kendini yenileme ve farklılaşma süreçlerini kontrol tuşuna regülatörleri tanımlamak için, biz bir model sistem olarak bir fare ilkel hematopoetik öncül hücre hattını EML kullanılır. Thhücre hattı fare kemik iliği 3,4 türetilmiştir edilir. Farklı büyüme faktörleri ile verildiğinde, EML hücrelerin in vitro 5 eritrosit, miyeloid ve lenfoid hücrelerine dönüştürmek olabilir. Önemli olarak, bu hücre hattı kültürü ortamı bunların multipotentiality tutma hala kök hücre faktörü (SCF) ihtiva eden ve büyük miktarda çoğaltılabilir. EML hücreler kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + alt popülasyonlar ayrılır ve kısmen yüzey belirteçleri CD34 ve SCA 6 dayalı Lin-SCA-CD34 hücreleri ayırt edilebilir. Kısa vadeli HKH&#39;lerin, SCA + CD34 + hücrelerde de benzer kendini yenileme edebiliyoruz. Hızla Lin-SCA + CD34 + ve Lin-SCA-CD34 hücre karışık bir nüfus yeniden ve 6 çoğalmaya devam edebilirsiniz SCF, Lin-SCA + CD34 + hücre ile tedavi edildiğinde. Popülasyonlar morfolojik olarak benzer ve c-kit mRNA ve protein 6 benzer seviyelerine sahiptir. Lin-SCA-CD34 hücreleri, IL-3 yerine SCF3 ihtiva eden ortam içinde yayılan yeteneğine sahiptirler. Unveiling hematopoiez sırasında erken gelişimsel geçiş hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sunacak EML hücre kaderinin kararda kilit düzenleyiciler. Kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-SCA-CD34 hücreleri arasındaki yatan moleküler farklılıkları araştırmak amacıyla, farklı şekilde ifade genleri tanımlamak için RNA-seg kullanılır. Transkripsiyon faktörleri hücre kaderini belirlemede önemli olduğu gibi, özellikle biz, transkripsiyon faktörleri odaklanmak. RNA-Seq profil ve genom 7,8 transkripsiyonu RNA&#39;lar ölçmek için (NGS) teknolojileri yeni nesil dizileme yeteneklerini kullanan yeni geliştirilmiş bir yaklaşımdır. Kısaca, total RNA, poli-A, ilk template.The RNA şablonu ile sonra ters transkriptazı kullanılarak cDNA&#39;ya dönüştürülür olarak seçilir ve parçalanmış. CDNA kütüphanesinin oluşturulması için sağlam olmayan bozulmuş RNA kullanılarak, tam uzunlukta RNA transkriptlerinin haritasını yapmak için önemlidir. Amaçlarlasekanslama poz, belirli bir adaptör dizileri cDNA&#39;nm her iki ucuna eklenir. Daha sonra, bir çok durumda, cDNA molekülleri, PCR ile amplifiye edilmiş ve yüksek verimli bir şekilde dizildi. Sekanslama sonra, elde edilen bir bir referans genom ve transkriptom veritabanına hizalanabilir okunur. Sayısı referans gen haritası sayılır ve bu bilgi gen salgılama seviyesini tahmin için kullanılabileceğini okur. Ayrıca sigara model organizmaların 9 transcriptomes incelenmesini sağlayan bir referans genom olmadan de novo monte edilebilir okur. RNA-DİZ teknolojisi aynı zamanda ek yeri izoformları 10-12, yeni transkriptler, 13 ve gen füzyonlarının 14 tespit etmek için kullanılmıştır. Protein kodlayan genlerin saptanması ek olarak, RNA Dizi aynı zamanda gibi kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, transkripsiyonu seviyesini roman tespit ve analiz etmek için kullanılabilir uzun siRNA&#39;nın vb 18 RNA 15,16, mikroRNA 17, kodlayıcı olmayan. Çünkü tBu yöntemin de hassasiyeti, tekli nükleotit varyasyonları 19,20 tespiti için kullanılmıştır. RNA-Seq teknolojisinin gelişiyle önce, mikrodizin gen ifadesi profili analiz etmek için kullanılan ana yöntem oldu. Önceden tasarlanmış probları sentezlenebilir ve daha sonra, mikro-dizi slayt 21 oluşturmak üzere bir katı yüzeye bağlanır. mRNA, ekstre edilmiş ve cDNA&#39;ya dönüştürülür. Ters transkripsiyon işlemi sırasında, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin cDNA dahil edilir ve cDNA mikrodizi slaytlar üzerine hibridize edilebilir. Belirli bir noktaya toplanan sinyalin yoğunluğu, bu noktada 21 spesifik prob bağlanma cDNA&#39;nın miktarına bağlıdır. RNA-Seq teknolojisi ile karşılaştırıldığında, mikrodizin çeşitli sınırlamalar vardır. RNA-Seq teknoloji kullanımını zaman sınırlar görece yüksek arka plan düzeyinde roman transkript tespit edebiliyor iken Birincisi, mikrodizin, gen şerhin önceden varolan bilgiye dayanır gene ifade seviyesi düşüktür. Bağlı arka plan ve sinyallerin doymaya mikrodizisinin hassasiyeti de, yüksek ve aşağı ifade edilen genlerin 7,22 ile sınırlıdır, oysa Bunun yanı sıra, RNA-Dizi teknoloji, algılama (8.000 kat) 7 çok daha yüksek bir dinamik aralığı vardır. Son olarak, mikrodizi probları bir örnek 23 içindeki farklı transkriptlerinin nispi temsil seviyelerini karşılaştırırken sonuçları daha az güvenilir hale hibritleştirme verimlilikleri, farklıdır. RNA-Seq mikrodizisinden üzerinden pek çok avantajı olmasına rağmen, veri analizi karmaşık. Bu, birçok araştırmacılar hala RNA-Sek yerine mikrodizisini kullanmak nedenlerinden biridir. Çeşitli biyoinformatik araçları RNA-Dizi veri işleme ve analiz 24 için gereklidir. Birkaç nesil dizileme (NGS) platformlar arasında, 454, Illumina, KATI ve İyon Torrent en yaygın kullanılan olanlardır. 454 ilk ticari NGS platform oldu. Diğer sıralama platformlar aksineBu tür Illumina ve bir katı halinde, 454 platformu okunmayacak oluşturur uzunluğu 25 (ortalama 700 baz kaydeder). Nedeniyle daha uzun daha yüksek verim 25 monte onların için transcriptiome ilk karakterizasyonu için daha iyi okur. 454 platformunun ana dezavantajı dizisinin megabase başına yüksek maliyet. Oluşturmak Illumina ve KATI platformları sayısının artması ve kısa uzunluklarda okur. Dizisinin megabase başına maliyet 454 platformu çok daha düşüktür. Nedeniyle Illumina ve SOLID platformları için okur kısa, çok sayıda, veri analizi çok fazla hesaplama yoğundur. İyon sel platformu için sıralama için alet ve reaktiflerin fiyatı ucuzdur ve sıralama süresi 25 daha kısadır. Ancak, hata oranı ve dizinin megabase başına maliyeti yüksek Illumina ve SOLID platformlara karşılaştırılır. Farklı platformlar kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve veri analizi için farklı yöntemler gerektirir. Platform sıralama amacı ve finansman durumuna göre seçilmelidir. Bu yazıda, bir örnek olarak Illumina RNA-Dizi platform almak. Biz EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma anahtar düzenleyicileri araştırmak için bir model sistem olarak EML hücresi kullanılan ve ifade seviyesi hesaplama ve roman transkript tespiti için RNA-Dizi kütüphane yapımı ve veri analizi yöntemleri ayrıntılı sağladı. Biz EML model sisteminde 2 RNA-seq çalışma, zaman fonksiyonel testi (örn ShRNA demonte) hematopoetik farklılaşma erken aşamalarında moleküler mekanizmasının anlaşılması açısından güçlü bir yaklaşım sağlamak ile birleştiğinde bizim önceki yayın göstermiştir, ve bir olarak hizmet verebilir genel olarak hücre kendini yenileme ve farklılaşma analizi için bir model.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD34 FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0341-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5981-81</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Lineage Antibody Cocktail</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558074</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special offer sysmtem</td>
			<td>FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 75cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430641</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell Culture Treated Flasks 25cm2</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I, Amplification Grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068-015</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140071</td>
			<td>BHK cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30228.02</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cell Depletion Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>Isolation of lineage negative cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoVue Plus spectrophotometer&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9569-62</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482; Napco&#8482; 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15-497-002&#160;</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>EML cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol&#174; Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>RNA exraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq&#8482; RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2002</td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td>Quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2545</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of key factors regulating self-renewal and differentiation in eml hematopoietic precursor cells by rna-sequencing analysis

Hematopoetik kök hücreler (HSC), lösemi ve lenfoma gibi birçok hastalıkta hastanın hematopoetik sistemi yeniden inşa etmek nakli tedavisi için klinik olarak kullanılmaktadır. HSC kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların tanıtılması araştırma ve klinik kullanım için HKH&#39;lerin uygulaması için önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni, in vitro proliferasyonu edemedikleri için HKH&#39;lerin büyük miktarda elde etmek mümkün değildir. Bu engeli aşmak için, bu çalışma için, bir model sistem olarak, bir fare kemik iliği türevi hücre hattı, EML (eritroid, miyeloid ve lenfositik) hücre hattı kullanılmıştır. RNA sıralaması (RNA-Dizi) giderek artan bir gen ifade çalışmaları için mikrodizisi değiştirmek için kullanılmıştır. Biz burada EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma düzenlenmesinde potansiyel anahtar faktörleri araştırmak için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu yazıda verilen protokol üç bölüme ayrılmıştır. Ilk part nasıl kültür EML hücreleri ve ayrı Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri açıklar. Protokolün ikinci bölümü, toplam RNA hazırlama ve yüksek sekanslama için daha sonra kütüphane yapımı için ayrıntılı prosedürler bulunmaktadır. Son bölüm RNA-Dizi veri analizi için yöntem açıklanır ve Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri arasındaki farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri belirlemek için verilerin nasıl kullanılacağını açıklar. En önemli ölçüde farklı olarak ifade transkripsiyon faktörleri EML hücre kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel kilit düzenleyiciler olduğu tespit edildi. Bu yazının tartışma bölümünde, bu deney başarılı performans için önemli adımlar vurgulayın. Özetle, bu kağıt EML hücrelerinde kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli regülatörleri belirlemek için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak bir yöntem sunar. Belirlenen anahtar faktörler in vitro ve i aşağı fonksiyonel analize tabi tutulurlarin vivo koşullarda.

Lin-CD34 + ve Lin-CD34 EML hücrelerinde farklı olarak ifade genlerin analiz etmek için, biz RNA-Dizi teknolojisi kullanılmaktadır. Şekil 1 prosedürlerin iş akışını gösterir. Manyetik hücre sıralama ile soy negatif hücrelerin izolasyonu sonra, Lin-SCA + CD34 + ve FACS Aria kullanılarak Lin-SCA-CD34 hücreleri ayrıldı. Lin-zenginleştirilmiş EML hücreleri, anti-CD34, anti-SCA1 ve soy kokteyl antikor ile boyandı. Sadece Lin- hücreleri Sca1 CD34 ifade analizi için geçitlendi. İki p...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis at JoVE.com

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...